蛛絲蛋白MiSp全長基因克隆、表達及結構和功能研究.pdf

1、圓網(wǎng)蜘蛛可分泌六種蛛絲蛋白纖維，分別在蜘蛛生命活動中扮演不同的角色。次壺腹腺絲(minor ampullate silk)主要用于構建蛛網(wǎng)核心框架和包裹獵物等，具有顯著的機械性能和優(yōu)異的生物親和性，加之在水環(huán)境中不會發(fā)生超收縮（超收縮會嚴重影響絲蛋白纖維的性能）等，是一種優(yōu)質的、難得的天然生物材料，在軍工、航空航天以及生物醫(yī)學工程領域有著巨大的潛在應用價值。
　　蜘蛛生性偏愛獨居（同類殘食），紡絲量也遠少于家蠶，因此無法像高密度飼

2、養(yǎng)家蠶一樣大規(guī)模獲取蛛絲纖維，嚴重阻礙了蜘蛛絲在現(xiàn)代科技生活中的大規(guī)模應用。自二十世紀九十年代以來，隨著生物技術日趨成熟，人們開始探索通過生物技術的方法制備人造蜘蛛絲，以滿足現(xiàn)代科技發(fā)展對高品質纖維材料的需求。多年來國內外多家研究機構專注于重組蛛絲纖維的仿生制備，但到目前為止尚未有一家機構能夠仿生類似天然蛛絲的人造蛛絲纖維，嚴重限制這種新型戰(zhàn)略資源的產(chǎn)業(yè)化。
　　長期研究表明，國內外蛛絲蛋白纖維的人工仿生之所以進展緩慢，主要是因為

3、現(xiàn)階段面臨三大瓶頸問題:1）蛛絲蛋白全長編碼基因克隆滯后:蛛絲蛋白編碼基因大、重復度高以及GC含量顯著等，常規(guī)PCR和小型cDNA文庫技術很難釣取全長編碼基因，經(jīng)過近25年的克隆研究國內外僅報道三種蛛絲蛋白全長基因序列（其中第二條為本論文克?。?2）全長編碼基因外源表達難以實現(xiàn):蛛絲蛋白全長編碼基因大，編碼的絲素蛋白達到300kDa左右;基因序列重復度高，容易出現(xiàn)基因重組和缺失等;蛛絲蛋白基因GC含量高，容易形成特殊的mRNA二級結構，

4、導致核糖體脫落和翻譯提前終止等;蛛絲蛋白中Gly和Ala使用頻率過高，表達過程中給宿主壓力太大;3）成絲機理研究不足:蛛絲蛋白分泌腺尺寸太小，腺體內環(huán)境（生理及化學條件）尚沒明確;蛛絲蛋白由N端和C端非重復調節(jié)區(qū)域以及中間重復區(qū)Rp組成，它們相互協(xié)調共同賦予液態(tài)蛛絲蛋白以及固態(tài)蛛絲纖維的高度可控特性和優(yōu)良品質，現(xiàn)階段相關NT和CT的結構和功能還沒有解析完全，Rp與絲性能的關系也不明確;次壺腹腺絲蛋白（minor ampullate sp

5、idroin，MiSp）中還包含特有的spacer間隔區(qū)，結構和功能還有待研究;由于腺體內環(huán)境以及蛛絲蛋白成絲機理研究的嚴重不足，致使人工纖維的仿生方法比較單一。
　　為系統(tǒng)性突破上述三個瓶頸問題，為產(chǎn)業(yè)化高品質重組蛛絲纖維奠定基礎，本論文首次以MiSp為研究對象，主要內容包括以下三個方面:
　　部分一:克隆鑒定MiSp全長編碼基因。大腹園蛛(Araneus ventricosus)是我國廣泛分布的蜘蛛種屬之一，絲纖維綜合品

6、質優(yōu)異，國內外多家研究機構均在進行A.ventricosus絲蛋白編碼基因的鑒定分析。次壺腹腺絲作為一種新型的蛛絲蛋白纖維，研究相對滯后，除了少量短的cDNA序列報道外，表達和仿生均無涉及。為了促進MiSp蛋白成絲機理的解析、全長MiSp蛋白重組表達、開發(fā)及仿生應用、為蛛絲蛋白的進化和表達調控研究增添新成員，本章基于前期構建的A.ventricosus大型fosmid基因組文庫和STS/3D-PCR技術篩選鑒定MiSp全長編碼基因序列。

7、經(jīng)過多輪篩選，我們得到含有A.ventricosus MiSp全長編碼基因的陽性克隆，外源插入片段約33kb左右(GenBank accession no.JX513956)，覆蓋MiSp全長編碼基因及其上游6647bp和下游14937bp非編碼序列。A.ventricosus MiSp全長編碼基因長10.9kb，由兩個外顯子(exon)和一個在蛛絲蛋白基因中首次發(fā)現(xiàn)的基因內含子（intron）組成。A.ventricosus MiSp

8、 intron長5628bp，以GT起始AG終止，符合intron的GT-AG法則。A.ventricosus MiSp全長轉錄子為5440bp，編碼的1766個氨基酸可劃分為N端和C端非重復區(qū)以及中間占到90％以上的重復區(qū)，其中重復區(qū)含有四種重復模塊（由Gly-X、Gly-Gly-X、Gly-Gly-Gly-X和poly-Ala組成）和兩個特有的DNA水平相似度為100％的間隔區(qū)（spacer，126個氨基酸殘基）。A.ventric

9、osusMiSp全長編碼基因組成結構揭示了蛛絲蛋白編碼基因intron-exon結構多樣性，上下游調控序列的比對分析為進一步研究蛛絲蛋白編碼基因的轉錄調控增添了新的保守性調控元件CACG。A.ventricosusMiSp全長編碼基因為國內外首條MiSp全長基因序列（世界上第二種全長蛛絲蛋白編碼基因序列），填補了國內外就A.ventricosus絲蛋白全長編碼基因克隆的空白，為國內外絲蛋白全長基因的研究增添新成員。
　　部分二:研

10、究MiSp結構和功能、解析組裝機制和成絲機理。常溫下，高濃度蛛絲蛋白經(jīng)過絲腺內部一系列物理和化學變化，在極短的時間內迅速轉變成性能顯著的固態(tài)蛛絲纖維，這一復雜的纖維化過程目前尚無系統(tǒng)性闡述。蛛絲蛋白主要由氨基酸水平高度重復的重復區(qū)域構成（Rp，占到整個蛋白90％以上），Rp兩端分別為N端(NT，約110氨基酸殘基)和C端非重復區(qū)（CT，約130個氨基酸殘基）。Rp區(qū)域主要與蛛絲纖維機械性能和品質相關，NT和CT則主要參與高濃度蛛絲蛋白儲

11、液的維持及纖維化過程中對蛛絲蛋白的多種調節(jié)作用。前期研究推斷拖絲蛋白(major ampullate spidroin，MaSp)NT和CT在蛛絲蛋白成絲過程中以相似的方式發(fā)揮調節(jié)作用，本論文研究則證實次壺腹腺絲蛋白MiSpNT和CT在蛛絲蛋白纖維化過程中以相反的作用方式分別扮演不同的角色。A.ventricosus MiSp除了擁有蛛絲蛋白典型的三個結構域NT、CT和Rp外，還含有兩個spacer區(qū)域。我們前期對Nephila cla

12、vipes主壺腹腺體的pH值(pH7.6-5.7，這是到目前為止測得的最寬pH范圍)和多種離子種類及濃度進行測試，并發(fā)現(xiàn)腺體導管中含有碳酸酐酶（催化CO2+H2O(→)HCO3-+H+反應維持pH梯度）。參照腺體內環(huán)境變化趨勢，我們對A.ventricosus MiSp NT、CT以及spacer的功能和結構進行了系統(tǒng)性研究:1）隨著pH從7.5降至5.0，MiSpNT逐漸二聚化且二聚體穩(wěn)定性逐漸增強，連接蛛絲蛋白單體形成牢固的蛛絲蛋白

13、多聚體，NaCl可維持單體穩(wěn)定性延緩NT二聚化;pH7.5至5.0，MiSpNT二級結構維持α-helix構象不變，高溫可誘導NT由α-helix向random coil可逆轉變。NMR高級結構顯示A.ventricosus MiSpNT單體由5個α-helix構成，Arg64和Glu115形成分子內鹽鍵，位于α-helix1和4上的兩個Cys形成分子內二硫鍵。與EuprosthenopsaustralisMaSp1NT不同，A.ven

14、tricosus MiSpNT中沒有參與MaSp1NT第三步二聚化的保守Glu84，但Asp109高度保守，揭示了MiSp不一樣的二聚化機制;2)我們首次發(fā)現(xiàn)隨著pH值的降低，A.ventricosus MiSp CT始終維持二聚體構象但二聚體穩(wěn)定性逐漸降低（與NT相反），與MiSpNT不同，pH7.5-6.5時CT的高溫變性過程可逆，二級結構由α-helix向random coil轉變，pH降至5.5時高溫可誘導MiSpCT由α-he

15、lix向β-sheet不可逆轉變。pH≦5.5時CT結構發(fā)生改變（解折疊）形成β-sheet淀粉狀(amyloid)納米纖維（通過透射電鏡和Congo染色證實），作為重復區(qū)Rp快速纖維化的晶核，NaCl對納米纖維的形成具有抑制作用，NT不具備形成β-sheetamyloid納米纖維的能力(pH7.5-5.0)。NMR高級結構證實A.ventricosus MiSp CT單體與MiSpNT相似，由5個α-helix構成，α-helix2和

16、4通過Arg43和Glu87形成鹽鍵，單體之間主要依靠疏水作用二聚化，其中α-helix5伸向對應單體內部形成發(fā)夾結構。導管末端pH值低以及HCO3-濃度上升，因此導管末端的pCO2較高，我們在分子水平證實C52（CO2類似物，CO2難以操控以及改變pH值）會與CT內部區(qū)域保守的疏水氨基酸結合改變蛋白高級結構，促進去折疊纖維化，NT則不受CS2的影響。碳酸酐酶、NT穩(wěn)定性增強以及CT穩(wěn)定降低的起始部位均發(fā)生在腺體的相同位置，證實CO2和

17、質子依懶型的蛛絲蛋白成絲新機制;3）不同于NT和CT，A.ventricosus MiSp spacer結構域不受pH值影響，維持α-helix構象不變，Tm值均為50℃左右，高溫可誘導spacer蛋白由α-helix向random coil轉變;A.ventricosus MiSp spacer主要為蛋白四聚體（存在少量單體構象），可拉近蛛絲蛋白分子形成復雜的蛛絲蛋白網(wǎng)鏈，增加絲纖維力學性能;NaCl可穩(wěn)定spacer單體構象，但不能

18、完全抑制蛋白四聚體的生成;A.ventricosus MiSp spacer可快速自組裝并纖維化，形成肉眼可見的短小絲纖維。通過對A.ventricosus MiSp NT、CT和spacer結構域系統(tǒng)性的結構和功能研究，建立了蛛絲蛋白全新的成絲機理模型，為高品質蛛絲蛋白纖維的仿生提供了新的制備工藝。
　　部分三:實現(xiàn)全長蛛絲蛋白的外源定向拼接。完整的蛛絲蛋白是制備高品質蛛絲纖維的保障，目前蛛絲蛋白的外源表達均是部分基因產(chǎn)物或是重

19、復模塊的嵌合體，與天然蛛絲蛋白存在較大差異，仿生的單絲纖維性能遠不及天然蛛絲。在過去十幾年科學家們多次嘗試不同的表達系統(tǒng)制備蛛絲蛋白，但效果均不理想。為了尋求適合全長蛛絲蛋白的制備方法，本論文首次以A.ventricosus MiSp全長編碼基因為研究對象，分別嘗試不同的外源表達方法制備全長蛛絲蛋白。A.ventricosus MiSp全長編碼基因大、Gla/Ala使用頻率高等，很難在大腸桿菌中全長表達。本論文首先1）以Rosetta2

20、(DE3)為宿主表達A.ventricosus MiSp全長編碼基因，SDS-PAGE顯示MiSp全長編碼基因難以表達或者表達量及其微小，而且還伴隨大量翻譯不完全的MiSp蛋白分子。為了尋求簡單高效的全長蛛絲蛋白的制備方法，本論文2）借助Rbintein的反式剪接技術，在國內外首次嘗試體外定向拼接全長A.ventricosus MiSp重組蛋白。我們將MiSp全長編碼基因分成兩部分，并分別與Rbn和Rbc融合表達，表達產(chǎn)物分別為AvMi

21、SpNTRbn和RbcAv MiSp CT。Av MiSp NT Rbn和RbcAv MiSp CT按等比例混合后，Rbn和Rbc在體外低濃度DTT誘導下相互識別并定向剪接，AvMiSpNT和AvMiSpCT隨著剪接反應通過肽鍵連接成為完整的MiSp蛋白。Intein介導的A.ventricosus MiSp全長蛋白拼接是一種全新的合成方法，可以有效的實現(xiàn)全長蛛絲蛋白（高分子量）的外源制備，為后續(xù)高品質重組蛛絲纖維的仿生和應用提供技術保