新型疏水性電荷誘導(dǎo)配基設(shè)計(jì)及層析分離抗體研究.pdf

1、單克隆抗體是一類重要的生物技術(shù)藥物，具有巨大的市場(chǎng)前景?；诘鞍譇親和層析的抗體分離過程存在一些局限，制約了抗體產(chǎn)業(yè)發(fā)展，開發(fā)經(jīng)濟(jì)高效的抗體分離新方法，具有重要的意義。疏水性電荷誘導(dǎo)層析(HCIC)是抗體分離的新方法，不過相關(guān)機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍不夠深入，分離工藝尚待完善，配基性能也有待提高。本論文以抗體分離為目標(biāo)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)手段和計(jì)算機(jī)分子模擬方法，分析HCIC分離的分子機(jī)制，設(shè)計(jì)新型配基，探討HCIC分離抗體的新工藝。
　　首先比較了H

2、CIC介質(zhì)（MEP HyperCel和Bestarose-4FF-MMI）和蛋白A親和介質(zhì)的吸附分離性能，進(jìn)行了單抗分離工藝的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的HCIC抗體分離工藝與蛋白A親和層析的效果接近，但仍有進(jìn)一步提升的空間。進(jìn)一步以牛血清白蛋白(BSA)為典型雜質(zhì)，系統(tǒng)考察了溶液條件（pH、鹽以及添加辛酸鈉等）對(duì)蛋白吸附和解吸行為的影響，探討了蛋白和MEP配基間的相互作用。通過調(diào)節(jié)pH、離子強(qiáng)度和添加辛酸鈉可以顯著提高HCIC結(jié)合抗體的選擇性，

3、有效降低BSA在HCIC介質(zhì)上的吸附，提高抗體分離的效率。
　　采用計(jì)算機(jī)分子模擬方法探討了HCIC配基和抗體間的相互作用，從分子尺度揭示了HCIC的分離機(jī)制。結(jié)果表明，抗體分子上存在多個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)，疏水相互作用、pi-pi、pi-陽離子以及氫鍵作用在配基-抗體結(jié)合過程中起了重要作用。證實(shí)了高配基密度對(duì)抗體吸附的重要性，并觀察到類似于誘導(dǎo)契合的蛋白構(gòu)象調(diào)整，以及典型的多位點(diǎn)協(xié)同作用。酸性條件下，堿性氨基殘基與質(zhì)子化的HCIC配

4、基間存在靜電排斥力，是蛋白解吸的主要推動(dòng)力。
　　通過分子動(dòng)力學(xué)模擬研究了抗體的Fc片段和天然的Fc特異性配基間分子識(shí)別和結(jié)合模式。結(jié)果顯示，疏水作用是特異性配基結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力。進(jìn)一步通過丙氨酸掃描方法，分析比較了配基-抗體間的相互作用能，鑒別出配基和Fc結(jié)合界面上的熱點(diǎn)殘基，提出了基于色氨酸或酪氨酸殘基的兩種結(jié)合模式，為仿生Fc親和配基的設(shè)計(jì)提供了指導(dǎo)。
　　設(shè)計(jì)了兩種HCIC新配基:氨基苯并咪唑（ABM）和色氨酸-氨基

5、苯并咪唑雙功能配基(W-ABM)，成功偶聯(lián)于瓊脂糖凝膠，制備了新型HCIC介質(zhì)，考察了吸附性能，并用于抗體分離。結(jié)果表明，在中性pH范圍內(nèi)，兩種介質(zhì)對(duì)IgG具有較高的飽和吸附容量，對(duì)BSA吸附量低，且對(duì)抗體吸附具有顯著的非鹽依賴特性。在弱酸性pH條件下，能夠?qū)崿F(xiàn)抗體的有效回收。兩種介質(zhì)的動(dòng)態(tài)載量受流速影響較小，在高流速下仍能維持較高的載量，性能優(yōu)于商業(yè)化的MEPHyperCel介質(zhì)。進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了模擬血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離抗體，結(jié)果表