人臍帶間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)工藝優(yōu)化及體外誘導分化.pdf

1、隨著生命科技突飛猛進的發(fā)展和醫(yī)學知識的不斷普及，臍帶間充質(zhì)干細胞的臨床意義已經(jīng)得到越來越多人們的認可。人臍帶組織中含有大量的間充質(zhì)干細胞，在用于肝硬化、心血管疾病、骨缺損修復、脊椎神經(jīng)損傷、肌肉衰退性疾病等疾病的臨床應用上具有巨大的應用潛力。目前，實驗和臨床應用的主要間充質(zhì)干細胞的細胞來源是骨髓，但因為骨髓存在許多局限性，例如在采集時需要通過骨穿刺，會在采集時帶給供體痛苦。除此之外，骨髓來源的間充質(zhì)干細胞采集數(shù)量較少，骨髓間充質(zhì)干細胞會

2、隨著供體年齡的增大而不斷減少，且病毒感染率較高。但臍帶來源的間充質(zhì)干細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞相比具有很多優(yōu)勢，臍帶視為新生兒廢棄物，取材容易，對母體和供體均無傷害，且存在的干細胞數(shù)量多，活性高，并可以多次使用，更為重要的是，臍帶間充質(zhì)干細胞具有非常低的免疫原性，臍帶間充質(zhì)干細胞分泌的細胞因子具有免疫調(diào)節(jié)的功能，并且可以提供造血支持，所以臍帶間充質(zhì)干細胞無論是在細胞來源或是臨床應用上都比骨髓來源的間充質(zhì)干細胞具有優(yōu)勢。但如何不斷優(yōu)化人臍帶間

3、充質(zhì)干細胞的分離和培養(yǎng)工藝，不但能明顯提高細胞數(shù)量、縮短細胞生長周期，還能節(jié)省原材料、時間和人力成本，已成為規(guī)模性企業(yè)不斷研究的目標。
　　本實驗的目的:1、通過不同的分離方法，優(yōu)化分離工藝，提高細胞數(shù)量。2、通過加入不同的生長因子，尋找出最適合的細胞體外培養(yǎng)條件。3、鑒定人臍帶間充質(zhì)干細胞的生物學特性。4、鑒定人臍帶間充質(zhì)干細胞的多向分化潛能。
　　本次實驗研究方法:1、通過組織塊爬片分離法和酶消化法從新生兒的臍帶中分離出

4、人臍帶間充質(zhì)干細胞，將兩種分離方法得到的細胞進行細胞數(shù)量、細胞傳代數(shù)和細胞傳代周期的統(tǒng)計學分析歸納比較，并對細胞進行表面抗原鑒定。用流式細胞儀對貼壁細胞進行鑒定是否高表達CD73、CD90和CD105，同時不表達CD45和CD34。2、取對數(shù)生長期的人臍帶間充質(zhì)干細胞，分別加入EGF、HGF和FGF三種生長因子進行體外培養(yǎng)，在第3、6、9天分別觀察計數(shù)，測定不同生長因子在體外培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞時對促進細胞增殖的作用。3、加入脂肪細胞

5、分化誘導培養(yǎng)基，進行脂肪方向分化，鑒定人臍帶間充質(zhì)干細胞的成脂分化潛能。4、加入成骨細胞分化誘導培養(yǎng)基，進行成骨方向分化，鑒定人臍帶間充質(zhì)干細胞的成骨分化潛能。
　　研究結(jié)論:1、通過實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用組織塊爬片分離法和酶消化法均能成功分離出臍帶間充質(zhì)干細胞。但通過組織塊爬片分離法分離臍帶得到的效果無論在細胞數(shù)量還是細胞傳代數(shù)及細胞傳代周期上均優(yōu)于酶消化法。組織塊爬片分離法可以在相對較短的時間內(nèi)得到較多數(shù)量的臍帶間充質(zhì)干細胞，同時

6、減少了細胞傳代數(shù)并縮短了細胞傳代周期。經(jīng)過酶消化法得到的細胞數(shù)量平均為1.53×107，組織塊爬片法分離得到的細胞數(shù)量平均為1.79×107。組織爬片分離法得到細胞不僅在數(shù)量上比酶消化法得到的細胞平均高出14.53％，而且所得到的細胞數(shù)據(jù)離散程度更小，數(shù)據(jù)更為穩(wěn)定，兩組數(shù)據(jù)呈顯著性差異(P＜0.05)，證明經(jīng)過組織爬片分離法分離培養(yǎng)得到的細胞在數(shù)量上優(yōu)于酶消化法，且經(jīng)過組織爬片分離法分離培養(yǎng)的細胞數(shù)量更為穩(wěn)定。酶消化法分離得到的平均細胞

7、培養(yǎng)天數(shù)為36.98天，平均傳代數(shù)3.09代，平均細胞傳代周期為12.23天/代;組織爬片分離法分離得到的平均細胞培養(yǎng)天數(shù)為23.60天，平均傳代數(shù)2.20代，平均細胞傳代周期為12.02天/代。組織爬片分離法得到的細胞平均培養(yǎng)天數(shù)比酶消化法得到的細胞平均培養(yǎng)天數(shù)減少了36.18％，兩組數(shù)據(jù)呈顯著性差異(P＜0.05)、平均傳代數(shù)減少了28.80％、平均細胞傳代周期縮短了1.72％。證明組織爬片分離法在細胞傳代周期上略優(yōu)于酶消化法，在縮

8、短細胞培養(yǎng)天數(shù)和傳代數(shù)方面均顯著優(yōu)于酶消化法。而且組織塊爬片分離法省去了酶消化的相關(guān)步驟，且因為細胞數(shù)量增多而傳代次數(shù)的減少，從而節(jié)省了原材料成本、時間成本和人力成本。對于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)運作的企業(yè)來說，處理樣本的工藝目標就是需要操作簡單、周期短、成本低。組織塊爬片分離法為企業(yè)的工藝優(yōu)化提供了可靠的理論基礎(chǔ)。2、經(jīng)流式細胞儀對組織爬片分離法和酶消化法分離得到的細胞進行細胞表面鑒定，鑒定結(jié)果表明兩種分離方法得到的細胞均高表達CD73、CD90和

9、CD105，同時不表達CD45和CD34，均符合間充質(zhì)干細胞的生物學特性，屬于典型的間充質(zhì)干細胞，證明組織爬片分離法和酶消化法分離出的細胞為臍帶間充質(zhì)干細胞。3、在體外培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞時，分別加入相同濃度20 ng/ml的EGF、HGF、FGF三種生長因子，第9天的細胞計數(shù)結(jié)果顯示，HGF和EGF對人臍帶間充質(zhì)干細胞的促進增殖作用明顯，EGF組的細胞增長率為135.3％，HGF組的細胞增長率為123.4％，但FGF組的細胞增長率僅

10、為10.93％。由此可見，HGF、EGF對人臍帶間充質(zhì)干細胞具有明顯的體外促進細胞增殖的作用。而單獨使用FGF時，對人臍帶間充質(zhì)干細胞無明顯的體外促進細胞增殖的作用。4、在獲得能穩(wěn)定傳代的臍帶間充質(zhì)干細胞后，取第三代細胞對其進行誘導分化，加入脂肪細胞分化誘導培養(yǎng)基，經(jīng)油紅O染色鑒定為脂肪細胞，證實了臍帶間充質(zhì)干細胞可以朝著脂肪方向分化，確定了所分離培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞具有多向分化的潛能，符合間充質(zhì)干細胞的生物學特性。5、在獲得能穩(wěn)定傳

11、代的臍帶間充質(zhì)干細胞后，取第三代細胞對其進行誘導分化，加入成骨細胞分化誘導培養(yǎng)基，經(jīng)茜紅素和Vonkossa's染色染鑒定為成骨細胞，證明了臍帶間充質(zhì)干細胞朝著成骨方向誘導成功，確定了所分離培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞具有多向分化的潛能，符合間充質(zhì)干細胞的生物學特性。
　　近十幾年來，國內(nèi)出現(xiàn)很多儲存新生兒臍帶間充質(zhì)干細胞業(yè)務的生物公司，但如何能做到既節(jié)省人力、原材料和時間成本，又能做到減少污染、提高細胞數(shù)量、避免動物源蛋白和病原物的污