金線蓮RAPD-SCAR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和不同種質(zhì)遺傳多樣性評(píng)價(jià).pdf

1、金線蓮是我國(guó)珍稀藥用植物，具有提高免疫力、抗衰老及降血糖的功效。近年來(lái)隨著野生資源的大量采挖，金線蓮資源瀕臨滅絕。同時(shí)，不同區(qū)域金線蓮種質(zhì)資源遺傳關(guān)系模糊，為金線蓮種質(zhì)資源的保存和鑒定帶來(lái)較大困難。本研究以來(lái)自不同生態(tài)區(qū)的20個(gè)金線蓮（Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl）野生資源作為試驗(yàn)材料，詳細(xì)研究了野生資源的快速離體保存方式。同時(shí)，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建和開(kāi)發(fā)了金線蓮多態(tài)性RAPD-SCAR標(biāo)記體系，并

2、對(duì)所收集的金線蓮種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳關(guān)系評(píng)價(jià)。主要研究結(jié)果如下：
　　1、金線蓮快速離體（莖段增殖）培養(yǎng)體系的優(yōu)化試驗(yàn)。金線蓮離體培養(yǎng)中，外植體的消毒是重要環(huán)節(jié)，不同消毒試劑及消毒時(shí)間對(duì)金線蓮腋芽活力有顯著影響。目前，兩種主流消毒液（2％次氯酸鈉、0.1%氯化汞）具有一定的毒性，處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)將造成組培苗毒害致死，處理時(shí)間不夠則會(huì)導(dǎo)致組培苗感染。為了獲取金線蓮離體培養(yǎng)最佳的消毒體系，本試驗(yàn)對(duì)2%次氯酸鈉、0.1%氯化汞的處理時(shí)間分別做

3、了5min、10min、15min、20min、25min五個(gè)水平的優(yōu)化，每個(gè)水平設(shè)20瓶重復(fù)，每瓶接種5個(gè)莖段，40d后觀察各水平的培養(yǎng)基感染率及金線蓮莖段萌發(fā)率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.1%氯化汞處理10min，外植體萌發(fā)率最高，達(dá)到70%。
　　為了獲取適合于金線蓮莖段增殖培養(yǎng)體系，對(duì)培養(yǎng)基中MS、6-BA、NAA配比進(jìn)行合理優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)了3因素3水平正交試驗(yàn)（共9組），每組試驗(yàn)設(shè)25個(gè)重復(fù)，在相同的條件下培養(yǎng)。以萌發(fā)率、植株的平均

4、株高作為評(píng)判金線蓮長(zhǎng)勢(shì)的指標(biāo)，分別在40d、80d、120d觀察金線蓮株高的動(dòng)態(tài)變化，了解金線蓮生長(zhǎng)曲線的同時(shí)探索最佳的因素配比。結(jié)果表明，1倍MS+2 mg/L NAA+0.5 mg/L6-BA作為金線蓮莖段增殖培養(yǎng)基，在40d、80d、120d時(shí)，平均株高均明顯高于其他試驗(yàn)組。
　　2、金線蓮DNA的提取方法優(yōu)化試驗(yàn)。金線蓮葉片富含多糖、多酚對(duì)金線蓮DNA質(zhì)量造成嚴(yán)重干擾。為了保證金線蓮下游分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)的順利進(jìn)行，本研究在傳統(tǒng)

5、的CTAB提取法的基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化提取步驟和提取試劑的最佳配比以獲取適合于金線蓮的高質(zhì)量DNA提取方法。結(jié)果表明，CTAB溶液中NaCl濃度提高至2.0mol/L，PVP濃度提高至4%，并使用高鹽TE（100 mmo1/L Tris-HC1，pH8.0；20 mmo1/LEDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）重沉淀DNA，能夠防止多糖多酚的污染。同時(shí)，在萃取步驟中利用氯仿：異戊醇（24:1）代替酚：氯仿：異戊醇（25:24

6、:1）能夠顯著減少酚類(lèi)物質(zhì)污染。通過(guò)上述方法的改進(jìn)，可以獲取較高質(zhì)量的金線蓮DNA，保證了下游的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)和序列測(cè)定的順利進(jìn)行。
　　3、金線蓮RAPD-SCAR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及遺傳多樣性評(píng)價(jià)。RAPD-SCAR標(biāo)記具有高效、便捷、重復(fù)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)。在20個(gè)不同產(chǎn)地金線蓮種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)RAPD標(biāo)記并將其換成特異SCAR標(biāo)記。從100條RAPD隨機(jī)引物中篩選出28條具有顯著多態(tài)性的引物，擴(kuò)增得到135條多態(tài)性位點(diǎn)。RAP