腎上腺髓質(zhì)素(ADM)對缺氧復氧誘導的大鼠近端腎小管上皮細胞凋亡的影響及其機制.pdf

1、目的：以大鼠近端腎小管上皮細胞(NRK-52E)缺氧復氧(H／R)模型模擬在體缺血再灌注損傷(IRI),通過轉(zhuǎn)染ADM真核表達質(zhì)粒,探討腎上腺髓質(zhì)素(ADM)對誘導細胞凋亡的影響及機制。
　　 方法：(1)正常培養(yǎng)的NRK-52E細胞,隨機分為四組:正常對照組、缺氧復氧(H／R)組、H／R+轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、H／R+轉(zhuǎn)染ADM質(zhì)粒組。(2)應(yīng)用FugeneHD轉(zhuǎn)染試劑,將pcDNA3.1／myc-hisB質(zhì)粒和ADM真核表達質(zhì)粒分別

2、轉(zhuǎn)染至NRK-52E細胞內(nèi),48h后制作腎臟H／R模型。(3)利用三氣培養(yǎng)箱調(diào)整氮氣壓力形成缺氧條件,缺氧1h,復氧1.5h后臺盼藍攝取法進行NRK-52E活細胞計數(shù)并計算細胞存活率,分光光度法檢測培養(yǎng)液上清乳酸脫氫酶(LDH)評價細胞活力；(4)AnnexinV和PI染色結(jié)合流式細胞儀技術(shù)檢測細胞凋亡；半定量反轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測ADM、Bax、Bcl-2、Fas的mRNA表達；Western印跡法檢測半胱氨酸天冬

3、氨酸蛋白酶3、8、9(Caspase-3、8、9)的蛋白質(zhì)表達。
　　 結(jié)果：1)ADM的mRNA表達變化:與對照組相比,H／R組ADM的表達顯著上調(diào)(P<0.05),與H／R組相比,轉(zhuǎn)ADM質(zhì)粒ADM的表達顯著上調(diào)(P<0.05)；2)活細胞計數(shù)、細胞存活率及LDH含量:H／R組活細胞計數(shù)和細胞存活率較對照組顯著下降(P<0.05),LDH含量顯著升高(P<0.05),轉(zhuǎn)ADM質(zhì)粒組活細胞計數(shù)和細胞存活率較H／R組顯著升高(P

4、<0.05),LDH含量顯著下降(P<0.05)；3)內(nèi)源性通路指標:與對照組相比,H／R組Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9表達均明顯上調(diào)(P<0.05),但Bax上調(diào)更為顯著,故Bax／Bcl-2升高(P<0.05),與H／R組相比,轉(zhuǎn)ADM質(zhì)粒組Bax、Caspase-3和Caspase-9表達下調(diào)(P<0.05),Bcl-2表達進一步上調(diào)(P<0.05),Bax／Bcl-2降低(P<0.05)。4)外源性

5、通路指標:與對照組相比,H／R組Fas和Caspase-8表達顯著上調(diào)(P<0.05),與H／R組相比,轉(zhuǎn)ADM質(zhì)粒組Fas和Caspase-8表達顯著下調(diào)(P<0.05)。5)流式細胞儀檢測細胞凋亡:H／R組NRK-52E細胞凋亡率顯著高于對照組(12.71％±1.38％vs1.39％±0.68％,p<0.01)。轉(zhuǎn)ADM質(zhì)粒組細胞凋亡率則較H／R組(3.84％±0.97％vs12.71％±1.38％)顯著下降(P<0.05)。轉(zhuǎn)空質(zhì)