不同時間血液灌流對膿毒癥兔促炎細胞因子及生存時間影響.pdf

1、背景：
　　 膿毒癥(sepsis)是由感染所致的全身炎癥反應綜合征,證實有細菌存在或有高度可疑感灶。膿毒癥-嚴重膿毒癥-膿毒癥休克-多臟器功能障礙-多臟器功能衰竭-死亡是很多病人的最終轉歸。目前,膿毒癥的發(fā)病機制主要包括:宿主自身免疫性損傷、腸道細菌移位和腸源性內毒素血癥、炎癥系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失衡、微循環(huán)和線粒體功能障礙綜合征。當病原體侵入機體時,會引起機體免疫應答反應。當免疫炎癥反應失控時,就會引起細胞因子風暴和炎癥介質瀑

2、布而導致膿毒癥。細菌感染可以用抗生素來治療,但是我們卻無法恢復腸道的屏障功能。而且抗生素殺死了細菌,也造成了內毒素的大量釋放。在這過程中,內毒素中的脂多糖(LPS)與宿主免疫系統(tǒng)作用后所激發(fā)的促炎細胞因子的分泌,與膿毒癥的嚴重程度及預后有密切關系。在這些促炎的細胞因子中,最重要的有TNF-α、IL-1、IL-6等。TNF-α:作為始發(fā)的細胞因子,其核心作用是在炎性反應中激活細胞因子級聯(lián)反應,誘發(fā)IL-1、IL-6、前列腺素等的分泌,由此

3、激發(fā)炎癥連鎖反應。TNF-α可引起發(fā)熱,誘導肝細胞急性期蛋白合成,并直接促進內皮細胞黏附中性粒細胞、單核細胞、嗜中性多型核白細胞(PMN)進入炎癥部位,釋放細胞因子,參與和放大SIRS,從而在啟動膿毒血癥過程中起主導作用。IL-1:協(xié)同TNF—α啟動膿毒血癥的炎癥反應,引起發(fā)熱,誘導肝細胞急性期蛋白合成,刺激單核細胞和巨噬細胞產生IL-6和TNF,并通過單核細胞和巨噬細胞產生IL-8介導對中性粒細胞的趨化作用,在膿毒癥發(fā)展過程中起放大作

4、用。IL-6:不僅能激活中性粒細胞,而且還能延遲吞噬細胞對衰老和喪失功能的中性粒細胞的吞噬,從而加劇了炎癥介質的產生；并可導致免疫功能失調。因此,阻斷和減少上述前炎癥細胞因子,或能成為有效治療膿毒癥的方法之一。
　　 血液凈化(blood purification)是指把患者血液引出體外并通過一種凈化裝置,除去其中某些致病物質,凈化血液,達到治療疾病的目的,這個過程即為血液凈化。血液灌流(hemoperfusion,HP)治療技

5、術將病人動脈血流經管道引向灌流器,血液經過灌流器時受到吸附劑或其他生物材料的作用而得到凈化或生化處理,灌流后的血液再經管路返回靜脈。HA型樹脂血液灌流器中的吸附劑是由苯乙烯/二乙烯苯聚合而成的大孔高分子聚合物,屬中性大孔樹脂,其通過調節(jié)反應體系溫度、攪拌速度,采用高分子懸浮聚合方法,控制交聯(lián)度和選擇致孔劑調節(jié)樹脂孔徑到特定的區(qū)間,選擇富含親脂疏水基團的交聯(lián)劑進行交聯(lián)使樹脂吸附劑具有親脂疏水性,合理調節(jié)包膜液體系沸點和干燥溫度調節(jié)膜孔徑,

6、然后選擇包膜液濃度和干燥速度控制膜厚度制作而成。生物相容性好,其吸附機理主要是通過中性大孔吸附樹脂作為吸附劑直接吸附清除血液中的相關致病物質,利用樹脂分子的三維網狀結構的分子篩作用行物理吸附與疏水基團的相互作用。特點是吸附容量大,吸附速度快,機械強度高,具有相對吸附特異性,能有效清除血中病理性分子,特別是對中大分子及蛋白質結合的病理性分子有相對特異性的吸附能力。目前臨床上已廣泛用于膿毒癥病人的治療。但在膿毒癥何時行血液灌流效果最佳?目前

7、在國內外尚無確定的答案。本文設想通過盲腸結扎穿孔法造成膿毒癥兔模型,然后根據盲腸結扎穿孔術后時間的不同,分組并分別對兔進行單次血液灌流,同時通過多個時間點檢測血清中與膿毒癥密切相關的促炎細胞因子TNF—α、IL-1β、IL-6濃度,比較其變化,并結合與膿毒癥預后密切相關的各實驗兔生存時間,以找出膿毒癥兔血液灌流最佳時機,從而為臨床膿毒癥病人血液灌流治療時間的選擇提供一個動物實驗依據,以期改善膿毒癥患者的預后。
　　 目的:

8、>　　 通過檢測兔血清中促炎細胞因子TNF—α、IL-1β及IL-6隨血液灌流選擇的時間不同而發(fā)生的濃度變化,結合生存時間,探討膿毒癥兔行血液灌流最佳時機。
　　 方法:
　　 1、42只雄性新西蘭大白兔隨機分成7組,每組6只,每只兔用戊巴比妥鈉靜脈麻醉后,均通過盲腸結扎穿孔法(CLP)制作膿毒癥模型,并行股動靜脈置管術以留待血液灌流的需要構成血液管路通道。
　　 2、各組分別在CLP術后3小時、6小時、9小時

9、、12小時、24小時、36小時用自制血液灌流器行單次血液灌流,灌流時間為2小時,速度為5ml/min;空灌流組則在CLP術后3小時行空灌流(用空灌流器灌流)作為實驗對照。
　　 3、各組兔在CLP手術前,術后3小時、6小時、9小時、12小時、24小時、36小時、48小時一共8個時間點抽取外周血標本2mL,離心后血清用ELISA法試劑盒集中檢測,板孔反應完畢加入終止液后用酶標儀在450nm波長測出OD值。利用標準孔OD值通過SPS

10、S軟件求出回歸方程,把各標本OD值代入方程,即可得到各血標本TNF—α、IL-1β及IL-6濃度。
　　 4、兔固定在手術臺上至死亡,定時觀察兔精神、呼吸、心率、體溫情況,并每天靜脈補充液體,液體量按80ml/kg,包括0.9％生理鹽水及10％葡萄糖溶液,總張力為1/4,記錄生存時間。
　　 5、統(tǒng)計軟件采用SPSS13.0,IL-6、IL-1β及TNF—α的濃度均用兩因素多水平的重復測量方差分析,干預因素為血液灌流(分

11、7組),測量時間因素有8個水平(8個測量點)。并分別對三個指標作線性相關性分析。生存時間用生存分析Kaplan—Meier法,并繪制生存曲線。檢驗水準定為α=0.05。
　　 結果:
　　 1、觀察指標結果:42只兔CLP術后約12小時均開始出現體溫升高,精神倦怠、呼吸、心率逐漸增快等癥狀,均于術后48小時至90小時間死亡。死后解剖兔,腹腔內均可見腸管表面及腹膜上有膿性分泌物,膿性或血性腹水,味臭,結扎部位下顏色黑紫,質

12、脆,并與周圍腸管及腹膜粘連。兔生存時間采用生存分析(Kaplan—Meier法),結果示各灌流組總體差異具有統(tǒng)計學意義(Chi—Square:57.313,P<0.001)；兩兩比較,12h灌流組生存時間最長(78.667±8.262小時)。
　　 2、檢測指標結果:
　　 (1)TNF—α:重復測量方差分析球形檢驗:W=0.000,P<0.001,不滿足球形假設,Greenhouse—Geisser校正系數為:0.26

13、5。主效應:不同灌流組間總體差異具有統(tǒng)計學意義,F值為18.231,P<0.001；重復測量因素8個不同時間點總體間差異具有統(tǒng)計學意義,F值為179.566,P<0.001。各灌流組間兩兩比較(LSD法):以術后3小時灌流組TNF—α平均濃度最低(80.750pg/ml),差異具有統(tǒng)計學意義；各重復測量點間兩兩比較:以術后6小時測量點TNF—α平均濃度最高(937.287 pg/ml),差異具有統(tǒng)計學意義。交互效應及單獨效應:重復測量時

14、間與不同灌流組交互水平:F值為5.531,P<0.001,說明重復測量時間與不同灌流組間有交互作用。當空灌流組在術后6小時的時候,TNF-α平均濃度最高。
　　 (2)IL-1β:重復測量方差分析:球形檢驗:W=0.000,P<0.001,不滿足球形假設,Greenhouse—Geisser校正系數為:0.150。主效應:不同灌流組總體間差異具有統(tǒng)計學意義,F值8.391,P<0.001;重復測量因素8個不同時間點總體間差異具有

15、統(tǒng)計學意義,F值96.566,P<0.001。各灌流組間兩兩比較(LSD法):以術后6h灌流組IL-1β平均濃度最低(36.160 pg/ml)；各重復測量點間兩兩比較:以術后9小時測量點TNF—α平均濃度最高(265.251 pg/ml)。交互效應及單獨效應:重復測量時間與不同灌流組交互水平:F值4.328,P=0.002,說明重復測量時間與不同灌流組間有交互作用。當24h灌流組在術后9小時的時候,IL-1β平均濃度最高。
　　

16、 (3)IL-6:重復測量方差分析:球形檢驗:W=0.000,P<0.001,不滿足球形假設,Greenhouse—Geisser校正系數為:0.162。主效應:不同灌流組總體間差異具有統(tǒng)計學意義,F值2.394,P=0.048；重復測量因素8個不同時間點總體間差異具有統(tǒng)計學意義,F值為91.880,P<0.001。各灌流組間兩兩比較(LSD法):以術后12h灌流組IL-6平均濃度最低(521.957 pg/ml)；各重復測量點間兩兩

17、比較:以術后12小時測量點IL-6平均濃度最高(4492.715 pg/ml)。交互效應:重復測量時間與不同灌流組交互水平:F值為0.903,P=0.512,說明重復測量時間與不同灌流組間無交互作用。
　　 結論:
　　 在膿毒癥早中期(CLP術后3小時至術后12小時)血液灌流能最有效地降低膿毒癥兔血TNF-α、IL-1β及IL-6濃度,且在膿毒癥中期行血液灌流(CLP術后12小時)還能使兔生存時間達到最長；表明在臨床上