野油菜黃單胞菌乙酰化酶基因的敲除及突變體遺傳特性的研究.pdf

1、黃原膠是由野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)經(jīng)過發(fā)酵而產(chǎn)生的一種胞外多糖，由于它特殊的理化功能，被廣泛應用在各個行業(yè)。黃原膠的生物合成是一個既細致又復雜的過程，需要各種酶及蛋白因子的參與，如乙?；?、尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶、縮酮丙酮酸轉移酶、五種特定的轉移酶和多聚酶。乙?；甘屈S原膠生產(chǎn)過程中一種非常重要的酶，它會影響黃原膠中乙?；暮?，而黃原膠的乙酰基含量與黃原膠的穩(wěn)定性及部分理化特性正相關，因此，本實驗

2、選取的研究對象為野油菜黃單胞菌的乙酰化酶基因。
　　本研究以野油菜黃單胞菌CICC10258作為試驗菌株，提取基因組DNA，根據(jù)基因序列設計特異性的引物，經(jīng)PCR擴增出乙?；富蚱?，與pMD19-T載體連接獲得重組質粒并成功克隆該基因。EcoRI酶切重組質粒獲得乙?；富虻腅coRI酶切片段，與EcoRI酶切回收的pK18mobSacB自殺質粒相連，構建重組自殺性質粒載體。經(jīng)鑒定，將重組自殺性質粒載體轉化野油菜黃單胞菌CIC

3、C10258的感受態(tài)細胞，成功獲得了乙?；富蛲蛔凅w。以野油菜黃單胞菌CICC10258作為對照，分析和檢測突變體的遺傳特性。結果表明，本實驗敲除了乙?；富虿@得突變體；突變體在營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中的生長受到抑制，突變體的黃原膠產(chǎn)量減少，突變體的三種胞外酶活性也受到抑制。經(jīng)與野油菜黃單胞菌CICC10258作為對照分析，證明乙?；富蚺c黃原膠的合成、三種胞外酶活性有關。該研究不僅為構建基因工程菌奠定了基礎，而且為野油菜黃單胞菌生產(chǎn)黃