高糖刺激對足細胞表型及GSK3β活性的影響.pdf

1、背景：糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是導致終末期腎臟病的重要原因,是威脅糖尿病患者生命健康的嚴重并發(fā)癥。蛋白尿是DN最常見的臨床表現,與DN的嚴重程度及病情進展密切相關。近年來,腎小球濾過屏障結構和功能的改變,尤其足細胞損傷在DN蛋白尿發(fā)生發(fā)展中的作用,已成為了眾多學者關注和研究的熱點。
　　 足細胞貼覆于腎小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)的外壁,是一種

2、高度分化的特殊的上皮細胞,對維持腎小球濾過屏障結構和功能的完整性發(fā)揮了關鍵作用。在某些刺激物的作用下,足細胞可發(fā)生上皮—間充質細胞轉分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),喪失足細胞特異性表型標志物,造成足細胞功能紊亂,最終導致腎小球濾過功能缺失。目前研究認為,主要有三條信號通路介導了足細胞EMT,即TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-catenin通路,糖原合成酶激酶

3、3β(glycogen synthase kinase3β,GSK3β)作為以上多條信號通路的參與者,可能在足細胞EMT過程中發(fā)揮了重要的作用。
　　 目的：
　　 通過觀察高糖刺激下小鼠足細胞是否發(fā)生表型的改變,以及GSK3β的表達量和活性的變化,探討足細胞損傷參與DN蛋白尿形成的可能機制及GSK3β在該過程中的作用,為DN的治療尋找新的靶點和理論依據。
　　 方法：以條件永生化小鼠足細胞(MPC-5)為研究對

4、象。
　　 1.高糖刺激對足細胞表型的影響:
　　 (1)不同濃度葡萄糖對足細胞表型的影響:用含不同濃度葡萄糖(12.5、25、50mmol/L)的1640培養(yǎng)基處理細胞36h,并設正常對照組(5.6 mmol/L葡萄糖)和高滲對照組(5.6 mmol/L葡萄糖+44.4 mmol/L甘露醇),采用Western Blot與RT-PCR的方法分別從蛋白及mRNA水平檢測足細胞表型標志物nephrin和問充質細胞表型標志物

5、α-SMA的表達;
　　 (2)高糖刺激不同時間對足細胞表型的影響:用含25 mmol/L葡萄糖的1640培養(yǎng)基處理細胞,采用Western Blot與RT-PCR的方法分別從蛋白及mRNA水平檢測不同時間點(0h、12h、24h、36h、48h)足細胞nephrin和α-SMA的表達。
　　 2.高糖刺激對足細胞GSK3β活性的影響及其與EMT的關系:
　　 按以下方法分組:①正常對照組:用含5.6 mmol/

6、L葡萄糖的1640培養(yǎng)基處理細胞;②高糖組:用含25 mmol/L葡萄糖的1640培養(yǎng)基處理細胞;③高滲對照組:用含5.6 mmol/L葡萄糖+19.4 mmol/L甘露醇的1640培養(yǎng)基處理細胞;④高糖+氯化鋰(LiCl)組:用含25mmol/L葡萄糖+20 mmol/L氯化鋰(鋰離子可選擇性抑制GSK3β的活性)的1640培養(yǎng)基處理細胞,36h后采用Western Blot的方法從蛋白水平檢測各組細胞nephrin、α-SMA、總G

7、SK3β以及9位絲氨酸位點(抑制位點)磷酸化的GSK3β(pSer9-GSK3β)的表達。
　　 結果：
　　 1.Western Blot與RT-PCR結果均顯示:(1)正常對照組和高滲對照組足細胞表達nephrin,僅少量表達α-SMA,而予不同濃度葡萄糖處理36h后,nephrin的表達水平隨葡萄糖濃度的升高呈劑量依賴性下調(P＜0.05),α-SMA的表達水平隨葡萄糖濃度的升高呈劑量依賴性上調(P＜0.05):(

8、2)高糖環(huán)境下足細胞nephrin的表達水平隨高糖作用時間的延長呈時間依賴性下調(P＜0.05),α-SMA的表達水平隨作用時間的延長呈時間依賴性上調(P＜0.05)。
　　 2.Western Blot結果顯示:正常對照組、高糖組、高滲對照組及高糖+氯化鋰組足細胞總GSK3β的表達無顯著性差異(P＞0.05)。與對照組相比,高糖組足細胞nephrin表達減少,α-SMA表達增多,pSer9-GSK3β表達減少(即GSK3β活化

9、),差異均具有統計學意義(P＜0.05);高糖環(huán)境下,用氯化鋰抑制GSK3β活性后,足細胞pSerg-GSKβp表達增多,但nephrin表達的減少及α-SMA表達的增多較高糖組反而更加明顯,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 1.在高糖刺激下,足細胞發(fā)生向間充質細胞表型的轉分化,且nephrin和α-SMA在蛋白及mRNA表達水平的改變呈劑量和時間依賴性。
　　 2.用氯化鋰抑制GSK3