Poly(I-C)激活TLR3抑制馬立克氏病毒感染及誘導MSB1細胞凋亡的機制.pdf

1、Toll樣受體家族(Toll-like receptor family)是一類典型的模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)，能夠識別病原相關分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)并激活下游相關信號通路，啟動固有免疫應答。Toll受體3(Toll-like receptor3，TLR3)是TLR家族中的重要成員，在抗病毒固有免疫應答中發(fā)揮重

2、要作用。TLR3識別病毒感染產(chǎn)生的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)結構后，通過Myd88非依賴性途徑，激活IRF3和NF-κB，誘導Ⅰ型干擾素和促炎性細胞因子的生成，抑制病毒的復制，限制感染的進一步擴散。研究表明，TLR3信號通路在抗皰疹病毒感染以及抗腫瘤免疫中起著不可替代的作用。
　　馬立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)是一種α亞科皰疹病毒，可引起以T細胞淋巴瘤和免

3、疫抑制為主要臨床特征的雞馬立克氏病(Marek's disease，MD)，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。MDV致病毒株感染雞通常要歷經(jīng)四個階段，即早期溶細胞感染階段、潛伏期階段、晚期溶細胞感染階段和轉化階段。轉錄組學數(shù)據(jù)顯示，在MDV感染的4個不同階段中，脾臟、法氏囊、胸腺等免疫器官中TLR3信號通路相關分子的轉錄水平都出現(xiàn)了顯著性變化。尤其是在晚期溶細胞感染和腫瘤轉化階段，TLR3信號通路相關分子的表達受到了明顯的抑制，暗示該信號通路

4、是宿主抗MDV免疫反應的一個重要組成部分。近期的研究結果表明，激活TLR3應答不僅能在體外有效抑制MDV的復制，同時也能夠明顯抑制體內(nèi)MD腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。但是TLR3信號通路如何抑制MDV感染和腫瘤生成，目前尚不清楚。
　　本研究主要通過轉錄組學、免疫學和分子生物學等研究方法，探索了激活TLR3信號通路對MDV感染的雞胚成纖維細胞以及MDV轉化的雞T細胞淋巴瘤細胞系的影響及其分子機制，為解釋TLR3在宿主抗MDV免疫應答中作用提

5、供了重要線索和數(shù)據(jù)。
　　1.Poly(I∶C)抑制MDV感染的機制
　　本研究通過在MDV感染CEF后不同時間點激活TLR3信號通路，探究TLR3應答對MDV不同復制階段的抑制效果。研究結果表明，MDV感染后的任意時間點激活TLR3均能有效降低MDV的病毒滴度和gB基因的轉錄水平。Real-time PCR檢測顯示poly(I∶C)處理后，MDV感染細胞中TLR3信號通路相關分子的表達水平顯著提高，其中TLR3、IRF3和

6、IKKα的上調表達水平最為顯著。同時IFN-β、IL-6和TNF-α等下游效應分子也出現(xiàn)相應的上調表達。我們又使用小分子抑制劑BX795和Resveratrol分別抑制TLR3介導的IRF3和NF-κB活化，探究Ⅰ型干擾素和促炎性細胞因子對MDV感染的影響。結果顯示，10μMBX795和100μM Resveratrol可分別有效抑制TLR3介導的Ⅰ型干擾素和促炎性細胞因子合成，且不顯著影響細胞活性。對于已感染MDV的CEF，無論是10

7、μM BX795還是100μMResveratrol都只能削弱但不能完全廢除TLR3激活對MDV感染的抑制效果。這表明TLR3信號通路誘導產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素和促炎性細胞因子均能在體外有效抑制MDV的感染。
　　2.Poly(I∶C)特異性誘導MD腫瘤細胞系MSB1凋亡
　　若干研究表明，dsRNA不僅能激活固有免疫，同時也可通過不同的作用機制誘導腫瘤細胞凋亡。MSB1細胞系是一種由MD腫瘤衍生而來的雞T淋巴瘤細胞系，但dsRN

8、A能否誘導MSB1細胞凋亡還未見報道。本研究使用合成的dsRNA類似物poly(I∶C)刺激MSB1細胞，通過形態(tài)學、分子生物學、細胞生物學、免疫學等多種方法檢測細胞是否發(fā)生凋亡。結果顯示，poly(I∶C)刺激能夠導致MSB1細胞的死亡而不引起包括DF-1、CEF、CEK、HD11以及DT40等在內(nèi)的其他禽源傳代細胞系或原代細胞死亡，同時MSB1細胞的死亡數(shù)量與poly(I∶C)終濃度和刺激時間呈顯著正相關。poly(I∶C)刺激后的

9、MSB1細胞出現(xiàn)崩解，折光性下降，與凋亡細胞的形態(tài)學變化相似。隨后的流式細胞術分析顯示，poly(I∶C)刺激組MSB1細胞的AnnexinV陽性細胞比例明顯高于對照組細胞，證明poly(I∶C)刺激引起了MSB1細胞的凋亡。與此同時，poly(I∶C)刺激后，MSB1細胞中Caspase3/7、8、9活性較對照組都有極顯著的上調，進一步確認了細胞凋亡的發(fā)生。JC-1染色結果證實MSB1細胞經(jīng)poly(I∶C)處理后出現(xiàn)線粒體膜電位丟失

10、，與Caspase9活性增強的結果相一致，暗示內(nèi)源性細胞凋亡途徑的激活。基因組DNA電泳分析結果顯示，poly(I∶C)刺激后的MSB1細胞基因組出現(xiàn)凋亡特征性DNA ladder，驗證了Caspase3的激活和凋亡的發(fā)生。而泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK可完全抑制poly(I∶C)誘導的MSB1細胞凋亡。綜上所述，本研究結果證實TLR3配體poly(I∶C)可通過Caspase依賴性途徑特異性誘導MD腫瘤細胞系MSB1的凋亡

11、，這一結果暗示poly(I∶C)可用于MD的防治和淋巴瘤的治療。
　　3.Poly(I∶C)誘導MSB1細胞凋亡的機制
　　TLR3信號通路已被證實可以通過多種方式誘導腫瘤細胞的凋亡。前期研究結果顯示TLR3配體poly(I∶C)能夠特異性誘導MD腫瘤細胞系MSB1凋亡。本研究通過小分子抑制劑、流式細胞術、熒光素酶報告系統(tǒng)、real-time PCR等技術手段，探究TLR3信號通路在poly(I∶C)誘導MSB1細胞凋亡中的

12、作用。首先，real-time PCR檢測結果顯示，poly(I∶C)誘導MSB1細胞凋亡的過程中，接頭分子TLR3、TRIF、TRAF6、RIP1、TANK、IKKα以及促凋亡分子Bak、p53、Fas等均出現(xiàn)顯著上調表達，IFN-β和TNF-α也出現(xiàn)對應的顯著上調表達，證明TLR3信號通路與poly(I∶C)誘導MSB1細胞凋亡有密切關系。隨后，我們使用小分子抑制劑Pepinh-TRIF、BX795和Resveratrol對TLR3

13、信號通路的不同接頭分子進行阻斷，探究TLR3信號通路在poly(I∶C)誘導MSB1細胞凋亡中的具體作用機制。經(jīng)過摸索，50μM Pepinh-TRIF、10μM BX795和50μM Resveratrol可分別有效阻斷MSB1細胞中接頭分子TRIF、IRF3和NF-κB的活化，且對MSB1細胞活性沒有明顯影響。接著我們將MSB1細胞用上述抑制劑進行處理，然后再用poly(I∶C)加以刺激。結果顯示，50μMPepinh-TRIF和5

14、0μM Resveratrol均可顯著抑制poly(I∶C)刺激引起的細胞死亡，且AnnexinⅤ陽性細胞比例和Caspase活性也都出現(xiàn)顯著下降;而10μM BX795對poly(I∶C)誘導的MSB1細胞凋亡沒有任何抑制作用。綜上所述，TLR3信號通路中的接頭分子的TRIF和NF-κB對poly(I∶C)誘導MSB1細胞凋亡是不可或缺的。本研究結果初步闡明了poly(I∶C)通過TLR3信號通路觸發(fā)MSB1細胞凋亡的分子機制，進一步