Cd2+單克隆抗體的制備及其免疫分析方法的研究.pdf

1、近年來，我國(guó)經(jīng)濟(jì)快速穩(wěn)步發(fā)展，人民的生活水平有了顯著的提高。然而在此過程中，人類也付出了十分慘重的代價(jià)。在世界范圍內(nèi)，尤其在我國(guó)，各種重金屬如汞、鎘、鉛、鉻等已經(jīng)對(duì)人類賴以生存和發(fā)展的自然環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染，同時(shí)也給廣大人民群眾的身體健康帶來了極大的威脅。鎘是一種高污染、高環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的重金屬，它是一種對(duì)環(huán)境有持續(xù)污染的物質(zhì)，可以通過生物富集作用和食物鏈進(jìn)入人體，生物半衰期長(zhǎng)達(dá)10~30年，容易累積于人體的腎臟、肝臟、骨骼等處，高濃度的鎘

2、對(duì)人體的臟器功能有很大的損害。重金屬離子的傳統(tǒng)測(cè)定方法存在一些不足之處，如操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)、檢測(cè)成本高昂、不便進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定等。因此，建立靈敏、快速、簡(jiǎn)便、成本較低和可用于現(xiàn)場(chǎng)的方法來檢測(cè)環(huán)境中的重金屬離子是非常有意義的。
　　與重金屬傳統(tǒng)的測(cè)定方法相比，重金屬免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)具備檢出限低、選擇性高、檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便節(jié)時(shí)、成本低廉、可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)。重金屬免疫學(xué)檢測(cè)方法主要有競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析方法(Enzyme-LinkedImm

3、unosorbentAssay,ELISA)、KinExA免疫檢測(cè)方法、熒光偏振免疫檢測(cè)方法(FluorescencePolarizationImmunoassay,FPIA)和膠體金免疫層析法(ColloidalGoldImmunochromatographyAssay,CGICA)等。本論文建立了Cd2+間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法及膠體金免疫層析法，主要內(nèi)容如下：
　　第一章：本章介紹了重金屬的定義、分布情況、污染危害及防治等；對(duì)重

4、金屬免疫分析技術(shù)和ELISA法做了簡(jiǎn)述；對(duì)膠體金免疫層析快速檢測(cè)技術(shù)的原理及其研究進(jìn)展進(jìn)行了概述，在此基礎(chǔ)上闡述了本論文的研究目的和主要內(nèi)容。
　　第二章：制備Cd2+單克隆抗體并建立測(cè)定Cd2+的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法。選擇雙功能螯合劑1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N,N,N’,N’-四乙酸(ITCBE)，分別與載體蛋白(牛血清白蛋白，BSA；卵清蛋白，OVA)和鎘離子連接，制備出免疫原(Cd-ITCBE-BSA)和包被抗原(

5、Cd-ITCBE-OVA)，采用免疫原免疫BALB/C小鼠，利用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)制備出針對(duì)鎘離子的單克隆抗體。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，Cd-EDTA濃度范圍在1-1000ng/mL內(nèi)建立快速檢測(cè)水樣中鎘離子的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。該方法的IC50為13.67ng/mL，檢測(cè)限為0.48ng/mL。該抗體與汞離子的螯合物的交叉反應(yīng)率為79.29％，除此之外，與Zn2+、Cr3+、Pb2+、Cu2+、Ni2+、Al3+、Co2+、Fe3+、M

6、g2+、Ca2+和Ba2+均無交叉反應(yīng)。超純水、自來水和湖水樣品中鎘的加標(biāo)回收率為87.78%~103.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為1.60%~11.41%。結(jié)果表明，建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法靈敏、快速，可用于水樣中Cd2+的檢測(cè)。
　　第三章：研制快速檢測(cè)水樣中鎘離子的膠體金免疫層析試劑條。采用競(jìng)爭(zhēng)法，將膠體金標(biāo)記的Cd2+單克隆抗體包被在金標(biāo)墊上，然后用包被抗原Cd-ITCBE-OVA和羊抗小鼠IgG在硝酸纖維素膜上依次劃線，分別作為

7、檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，3~5min后根據(jù)條帶顯色情況判斷結(jié)果。實(shí)驗(yàn)對(duì)試劑條進(jìn)行靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度驗(yàn)證，并檢測(cè)加標(biāo)水樣。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，在羊抗小鼠IgG稀釋倍數(shù)為200倍，包被抗原濃度為0.25mg/mL時(shí)，試劑條對(duì)鎘離子的檢出限為100ng/mL。除與汞離子的螯合物有交叉反應(yīng)外，與Zn2+、Cr3+、Pb2+、Cu2+、Ni2+、Al3+、Co2+、Fe3+、Mg2+、Ca2+和Ba2+均無交叉反應(yīng)。對(duì)湖水的加標(biāo)檢測(cè)結(jié)果