水牛SCAP和SREBP1基因的克隆、表達(dá)規(guī)律和多態(tài)性檢測研究.pdf

1、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種膜結(jié)合蛋白，具有一個固醇感受區(qū)域，能感應(yīng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的變化;固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上一種膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，受SCAP刺激后能激活一系列與脂肪酸合成相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。SCAP和SREBP1共同維持細(xì)胞內(nèi)固醇水平的穩(wěn)態(tài)，在生物體脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究以水牛SCAP和SRBEP1為研究對象，初步探討其與水牛產(chǎn)奶性能的關(guān)系，首先進(jìn)行基因的克

2、隆并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;其次研究水牛SCAP和SREBP1基因在不同組織、不同泌乳期乳腺組織和高低產(chǎn)水牛奶中的表達(dá);最后采用DNA直接測序方法檢測SCAP、SREBP1基因的多態(tài)性位點(diǎn)，為下一步根據(jù)這些基因的多態(tài)位點(diǎn)篩選出與水牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNPs標(biāo)記打好基礎(chǔ)，本研究主要結(jié)果如下:
　　1.SCAP、SREBP1基因的克隆
　　根據(jù)Genbank上公布的牛SCAP基因(NC_007320)和SREBP1基因(NC_00

3、7317)設(shè)計引物進(jìn)行克隆，經(jīng)測序得到4214 bp的SCAP基因mRNA序列4214 bp，其開放閱讀框?yàn)?837 bp，和3961 bp的SREBP1基因mRNA序列，其編碼序列長3438 bp;分析水牛SCAP和SREBP1與牛、人、豬、綿羊、馬、小鼠、大鼠、兔和狗CDS同源性分別為99％、98％、89％、96％、89％、85％、85％、87％、89％和98％、86％、88％、96％、87％、79％、80％、82％、86％,并構(gòu)建

4、進(jìn)化樹分析得到水牛與牛進(jìn)化距離最近，說明SCAP和SREBP1在不同物種間具有保守性。
　　2.SCAP、SREBP1基因的mRNA表達(dá)水平研究
　　以GAPDH為參考基因，提取水牛心、肺、腎、上皮、脾、卵巢、乳腺、腦、大腸、小腸、瘤胃、皺胃、瓣胃、肌肉、脂肪、淋巴、肝、胰組織，泌乳7d、50d、280d水牛乳腺組織，高產(chǎn)和低產(chǎn)水牛奶的RNA作為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，結(jié)果:(1)不同組織中，SCAP基因在乳腺中表達(dá)量最

5、高，在淋巴中表達(dá)量最低;SREBP1基因在乳腺組織中的表達(dá)量最高，在肌肉中表達(dá)量最低，說明SCAP和SREBP1基因與水牛乳腺的功能相關(guān);(2)不同泌乳期乳腺中，SCAP基因的表達(dá)量為7 d＞50 d＞280 d，SREBP1基因的表達(dá)量為50 d＞7 d＞280 d，說明SCAP基因?qū)λＣ谌榈陌l(fā)動有一定的促進(jìn)作用，SREBP1基因能促進(jìn)水牛乳腺泌乳;(3)SCAP和SREBP1基因在高產(chǎn)水牛奶中的表達(dá)量均明顯高于低產(chǎn)水牛奶，說明SC

6、AP和SREBP1對水牛泌乳量有影響。由此可推測SCAP和SREBP1基因與水牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)聯(lián)。
　　3.SCAP、SREBP1基因多態(tài)性位點(diǎn)的檢測
　　PCR擴(kuò)增18頭水牛血液基因組DNA，產(chǎn)物直接測序檢測基因多態(tài)位點(diǎn)。得到SCAP基因共30個SNPs，25個位于內(nèi)含子區(qū)、5個位于外顯子區(qū)，其中有1個錯義突變、4個同義突變;SREBP1基因共23個SNPs，14個位于內(nèi)含子區(qū)，9個位于外顯子區(qū)，其中有5個錯義突變、4個同義