Subcellular proteomic approach for identifying signaling effectors PKC-β2 under high glucose in HUVEC.pdf

1、研究背景:
　　 隨著目前全球糖尿病的患病率不斷增加,糖尿病日益成為普遍而嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題,其特征性的血管并發(fā)癥是糖尿病患者致盲、致殘、致死的主要原因。在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂被認(rèn)為是重要的始動(dòng)因素。近年來(lái),大量研究顯示,蛋白激酶C(PKC)的激活可能是糖尿病血管病變重要的發(fā)病機(jī)制之一。在眾多的PKC亞型中,PKC-β2亞型在血管病變關(guān)鍵靶細(xì)胞—內(nèi)皮細(xì)胞中優(yōu)勢(shì)表達(dá),高糖應(yīng)激介導(dǎo)的PKC-β2激活可能

2、是糖尿病血管病變重要病理生理鏈中的匯聚焦點(diǎn)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而既往的研究?jī)H僅關(guān)注某一己知信號(hào)通路,針對(duì)PKC-β2亞型信號(hào)機(jī)制特征的全景式描述仍有待闡明。目前,在亞細(xì)胞水平,人們對(duì)于PKC亞型調(diào)節(jié)其下游分子間相互交聯(lián)作用的過(guò)程知之甚少。本文旨在探索高糖條件下內(nèi)皮細(xì)胞亞細(xì)胞水平上與PKC-β2信號(hào)通路相關(guān)的新的潛在的效應(yīng)子。
　　 目的和方法:
　　 為了對(duì)高糖條件下內(nèi)皮細(xì)胞的亞細(xì)胞組分中與PKC-β2信號(hào)通路相關(guān)的新的潛在的

3、蛋白質(zhì)進(jìn)行分析鑒定,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腺病毒載體轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建了PKC-β2持續(xù)激活的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模型系統(tǒng),并將其置于高糖環(huán)境中培養(yǎng)。在隨后進(jìn)行的二維(2-DE)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中,共分4組處理細(xì)胞:正常葡萄糖對(duì)照組(NG,含5.6mmol/L D-葡萄糖);高糖組(HG,含25mmol/L D-葡萄糖);空載體對(duì)照組(EV,Ad5-Null轉(zhuǎn)染細(xì)胞后培養(yǎng)于25mmol/L的高糖培養(yǎng)基中);PKC-β2過(guò)表達(dá)組(PO,Ad5-PKC-β2轉(zhuǎn)染細(xì)

4、胞后培養(yǎng)于25mmol/L的高糖培養(yǎng)基中)。隨后采用經(jīng)典的亞細(xì)胞分離方法抽提細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及其蛋白。運(yùn)用包括二維(2-DE)凝膠電泳,質(zhì)譜分析在內(nèi)的蛋白組學(xué)研究策略對(duì)蛋白表達(dá)譜的變化進(jìn)行分析。最后具有代表性的蛋白表達(dá)量的變化最終通過(guò)免疫印跡法得到證實(shí)。此外,我們通過(guò)運(yùn)用BioGRID3.1生物相互作用數(shù)據(jù)庫(kù),將蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)中得到差異表達(dá)蛋白用人類蛋白.蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系起來(lái),網(wǎng)絡(luò)圖顯示了高糖條件下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中潛在的與PKC-β

5、2信號(hào)通路相關(guān)的蛋白的交聯(lián)作用。
　　 結(jié)果:
　　 (1)本實(shí)驗(yàn)分別得到了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核組分蛋白和細(xì)胞質(zhì)組分蛋白的凝膠雙向電泳圖譜。在細(xì)胞核蛋白的雙相電泳圖譜中每組檢測(cè)到大約800個(gè)蛋白點(diǎn),通過(guò)組內(nèi)、組間的交叉匹配和比對(duì),共發(fā)現(xiàn)38個(gè)點(diǎn)的蛋白表達(dá)量發(fā)生了顯著改變(±1.5倍,p＜0.05),并將它們定義為高糖誘導(dǎo)下的PKC-β2相關(guān)核蛋白。在細(xì)胞質(zhì)組分蛋白的雙相電泳圖譜中每組中檢測(cè)到接近600個(gè)蛋白點(diǎn),共發(fā)現(xiàn)2

6、8個(gè)點(diǎn)蛋白表達(dá)量發(fā)生了明顯改變(±1.5倍,p＜0.05)。(2)通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離時(shí)間飛行質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)對(duì)以上蛋白表達(dá)量發(fā)生改變的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析及生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)查詢,經(jīng)鑒定后篩選出50個(gè)差異表達(dá)蛋白,并這些差異蛋白分類如下:①生物合成和代謝相關(guān)蛋白;②蛋白激酶家族相關(guān)蛋白:③細(xì)胞周期,細(xì)胞凋亡和增殖相關(guān)蛋白;④轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)蛋白?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果,鑒定出了高糖條件下PKC-p2信號(hào)通路下游可能存在的多種新的

7、重要效應(yīng)子:絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3),蛋白質(zhì)DBF4同源蛋白B(DBF4B),細(xì)胞分裂周期蛋白7(CDC7),過(guò)氧化物酶增殖激活受體δ(PPARδ),核轉(zhuǎn)錄因子-kB抑制作用Ras樣蛋白(NKIRAS1),這些蛋白分別參與了糖脂對(duì)話,炎癥反應(yīng),細(xì)胞增殖,細(xì)胞周期等多個(gè)生物進(jìn)程。(3)在己鑒定的蛋白質(zhì)中,我們又對(duì)其中兩種蛋白:PPARδ、NKIRAS1用免疫印記法進(jìn)行更加深入的驗(yàn)證。結(jié)果顯示,PKC-β2持續(xù)激活下調(diào)了PPARδ

8、在細(xì)胞核中的蛋白量表達(dá)和下調(diào)了NKIRAS1在細(xì)胞質(zhì)中的蛋白量表達(dá)。(4)此外,在這50個(gè)經(jīng)質(zhì)譜鑒定的差異表達(dá)蛋白中,人類蛋白.蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖將其中14個(gè)蛋白成功聯(lián)系起來(lái)。
　　 結(jié)論:
　　 本研究首次運(yùn)用亞細(xì)胞和功能蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,通過(guò)對(duì)比差異蛋白表達(dá)譜的變化,探討了高糖條件下內(nèi)皮細(xì)胞的PKC-β2亞型下游效應(yīng)子在亞細(xì)胞水平上的變化。我們發(fā)現(xiàn)了,PKC-β2可能通過(guò)調(diào)控PPARδ參與高糖環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)的糖脂對(duì)話。