中棉所36花發(fā)育均一化cDNA文庫構建及EST分析.pdf

1、分類號華中農業(yè)大學碩士學位論文中棉所36花發(fā)育均一化cDNA文庫構建及EST分析ConstruetionofNormal撫edeDNALibraryandAnalysisonExPressedSequenceTagso仃heFlowerDeveloPmentofCCRI36碩士研究生:劉俊杰指導教師:喻樹迅研究員指導小組:喻樹迅研究員范術麗副研究員宋美珍副研究員專業(yè):作物遺傳育種研究方向:棉花遺傳育種獲得學位名稱:農學碩士獲得學位時間:

2、2008年6月20日華中農業(yè)大學植物科學與技術學院二00八年六月華中農業(yè)人學2008屆碩[學位論文2.3CDNA的合成.................................................................................................……212.3.1合成cDNA第一鏈..............................................

3、...……212.3.2cDNA擴增(Long一distancePCR，LD一PCR)........................................……222.4cDNA的均一化...............................................................................……222.4.1特異降解雙鏈DNA酶(DSN)的稀釋................

4、..................................……222.4.2DsN活性檢測..................................................................................……222.4.3準備用于均一化的雙鏈cDNA...............……，...........................................……23

5、2.4.4雜交.............................................................................................................……232.4.5DSN處理..........................................................................................

6、...........……242.4.6對DSN處理的樣品進行第1次PCR擴增.............................................……252.4.7對DSN處理的樣品進行第2次PCR擴增.............................................……262.5蛋白酶處理...................................................

7、.................................................……262.6sfil酶處理...........................................................……272.7用ChromaSPIN一400將cDNA按分子大小分級分部............................……272.8處理后dscDNA與載體pDNR一LIB連接.....

8、............................................……282.9連接產物轉化(以下操作均在無菌環(huán)境下進行)....................................……292.10均一化文庫滴度檢測..................................................................................……292.n均一化文庫插

9、入片斷長度檢測..................................................................……302.12cDNA均一化效果分析...............................................................................……302.12.1虛擬Nthemblot(VirtualNthemblot)..........

10、....................................……303實驗結果與分析................................................……343.1總RNA的提取...........................................................……343.2mRNA的分離.....................................

11、.........................……353.3mRNA反轉錄成全長cDNA.........................................................................……363.4均一化...........................................................................................

12、................……363.4.1全長cDNA的均一化................................................................................……363.4.2均一化cDNA的第二次擴增....................................................................……373.5用ChromaS

13、PIN一400將cDNA按分子大小分級分部.............................……383.6克隆數(shù)目和重組率的鑒定............................................................................……383.7插入片斷長度的檢測............................................................

14、.....................……393.8均一化cDNA文庫的均一化效果分析.......................................................……404討論.................................................................................................................

15、.....……414.1取樣.................................................................................................................……414.2棉花總RNA的提取.......................................……414.3mRNA的純化及反轉錄....................

16、............................................................……424.4均一化全長cDNA文庫................................................................................……424.5DSN法與其它均一化方法的比較........................................