植物脫落酸受體PYL10在脫落酸結合前后的液體核磁共振動態(tài)特性研究.pdf

1、蛋白質是生物體行使功能的最重要的生物大分子之一，研究蛋白質在生理過程中的作用機制能夠幫助我們更好的了解生命的意義。大部分蛋白質功能的實現(xiàn)依賴著其動態(tài)變化，核磁共振由于能夠研究生物大分子在不同時間尺度上的運動特性而成為研究蛋白質動力學和作用機制的重要工具。本文應用生物化學方法分析了植物激素脫落酸(ABA)在擬南芥中的水溶性受體家族RCAR1/PYR/PYL中的成員PYL10對其下游信號因子2C類蛋白磷酸酶PP2C的作用機制。糾正了前人因偶

2、然因素得出“PYL10是一類不依賴于ABA的受體”的結論。本文還進一步應用液體核磁共振弛豫測量和約化譜密度函數(shù)分析方法揭示了PYL10在ABA結合前后的動態(tài)特性，表明PYL10在結合ABA之后使得其結構熵和蛋白質柔性的增加。同時，本文還介紹了發(fā)展和應用無標記（Label-Free）質譜定量檢測的方法研究大腸桿菌酪氨酸激酶C端酶活結構域(ETK-CTD)在磷酸化過程中的關鍵位點Tyr574的磷酸化水平的動態(tài)變化的工作，及簡要介紹了植物內向

3、整流鉀離子通道KAT1的初步電生理研究。
　　第一章先簡要介紹了ABA受體的發(fā)現(xiàn)和分類。接著對水溶性的ABA受體RCAR1/PYR/PYL家族介導的ABA信號通路的主要內容及其在植物體中的重要功能、RCAR1/PYR/PYL家族ABA受體結合ABA時的結構變化和發(fā)揮作用的機制進行了重點介紹。
　　第二章主要介紹了基于液體核磁共振自旋弛豫的蛋白質動力學分析方法，并相關研究表明熱力學原理和動力學的結合能夠更好地解釋蛋白質-配體或

4、者蛋白質-蛋白質相互作用機制。
　　第三章介紹了采用鉬酸鹽與磷酸根的顯色反應檢測PYL10在體外對PP2C(HAB1)磷酸酶活性的抑制，發(fā)現(xiàn)了與之前報道的結果（ABA非依賴性）相反的結果，即ABA依賴性，且這種依賴性會受到外源蛋白牛血清蛋白(BSA)的影響。生化分析結果表明PYL10和BSA不能形成穩(wěn)定的復合物。
　　第四章針對BSA不是通過與PYL10直接相互作用影響其功能，可能是使PYL10蛋白的動力學發(fā)生了變化而對功能

5、產(chǎn)生影響。我們對自由狀態(tài)的PYL10(apo-PYL10)和結合有ABA的PYL10(ABA/PYL10)進行了液體核磁共振主鏈歸屬、弛豫數(shù)據(jù)的采集和約化譜密度函數(shù)分析以及ABA滴定實驗，結果表明PYL10對PP2C的磷酸酶活性抑制作用是通過ABA介導的主鏈柔性以及構象熵的增加實現(xiàn)的。
　　第五章我們分別采用Label-Free質譜相對定量和Western-blot定性分析了ETK-CTD在磷酸化過程中自磷酸化位點Tyr574磷酸