CPT誘導人外周血源破骨細胞凋亡的分子機制研究.pdf

1、目的：腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（Tumor Necrosis factor-related apoptosis- inducing ligand，TRAIL）是腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis factor，TNF）超家族新成員。體外實驗發(fā)現(xiàn)可誘導多種組織來源的腫瘤細胞凋亡，而對正常組織細胞幾乎沒有影響。但有關TRAIL對破骨細胞作用的研究報道并不多見。繼往的研究已證實環(huán)化變構腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（Circular

2、 Permuted TRAIL,CPT；北京沙東生物技術有限公司研發(fā)）可以較TRAIL更有效地誘導腫瘤細胞凋亡。我們研究CPT對人外周血來源的破骨細胞的作用，在mRNA水平分析化療藥作用后其兩種CPT死亡受體和兩種誘騙受體表達的變化，探討CPT對破骨細胞的作用機制，為臨床骨髓瘤骨病等的治療新的治療方法和理論依據。
　　方法：
　　1.人外周血來源破骨細胞細胞培養(yǎng)
　　采取健康人外周血10ml，共6人份。淋巴細胞分離液無

3、菌分離PBMC，接種24孔板，接種密度分別為5×105、1×106、2×106細胞/每孔，加入含30ng/ml M-CSF+30ng/ml RANKL培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)21天形成貼壁、胞體較大形狀不規(guī)則且多核（大于等于3個核）的細胞。
　　2.破骨細胞的鑒定
　　2.1 抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)試劑盒染色，多個核（大于等于三個核）、胞體較大、酒紅色細胞

4、為成熟破骨細胞。取出24孔細胞培養(yǎng)板中的預置爬片，按照TRAP染色步驟進行染色。用顯微鏡（100×）普通光照下觀察并拍照。每次取4個孔，隨機選取10個視野計數3個核以上的破骨細胞。
　　2.2 掃描電子顯微鏡觀察破骨細胞作用于牛皮質骨片后形成的骨吸收陷窩。
　　3.CPT誘導破骨細胞的凋亡
　　3.1 不同濃度CPT對破骨細胞作用，CPT藥物濃度分別為0ng/ml、100ng/ml、500ng/ml，作用24小時、48

5、小時后進行TRAP染色，倒置顯微鏡下觀察破骨細胞形態(tài)變化。
　　3.2 Annexin V–FITC熒光染色法檢測CPT誘導破骨細胞凋亡：將CPT0ng/ml、100ng/ml、500ng/ml處理后的破骨細胞在 Annexin V–FITC熒光染色劑中37℃孵育15分鐘，熒光顯微鏡下觀察凋亡的破骨細胞。
　　4.RT-PCR法檢測破骨細胞中 CPT受體 mRNA表達變化的影響以0ng/ml、100ng/ml、500ng/m

6、lCPT處理破骨細胞24h、48h后，實時熒光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，RT-PCR）法檢測DR4、DR5、DcR1及DcR2 mRNA水平表達變化，分析其與CPT誘導的破骨細胞凋亡的相關性。
　　5.統(tǒng)計學：應用 SPSS19.0(SPSS Inc,USA)軟件對數據進行單因素方差（one-way ANOVA）分析，統(tǒng)計結果以平均值±標準差表示。大寫字母代表著差異性

7、極顯著（P<0.01）；小寫字母代表著差異性顯著（P<0.05）。
　　結果：
　　1.外周血單個核細胞經M-CSF及RANKL誘導21天后顯微鏡下可見到大量成熟的破骨細胞，其形態(tài)學特征為：細胞體積較大，細胞漿豐富呈酒紅色，多核，細胞核≥3個，甚至多達數十個。該細胞進行TRAP染色呈現(xiàn)陽性（酒紅色），進行骨片吸收實驗顯示其較強的骨吸收活性。證實可以經 PBMC誘導形成具有骨吸收活性的破骨細胞。在相同的培養(yǎng)條件下PBMC細胞在

8、2×106個/ml接種密度下，誘導形成的破骨細胞數量為50.2±11.6/HPF，于5×105個/ml誘導形成的破骨細胞數量18.0±6.37/HPF及1×106個/ml誘導形成的破骨細胞數量36.4±9.54/HPF相比，誘導形成的破骨細胞數量最多。
　　2.CPT誘導破骨細胞凋亡形態(tài)學變化，顯微鏡下觀察到CPT作用24小時后破骨細胞出現(xiàn)空泡化、變形，48h后破骨細胞的封閉帶出現(xiàn)破裂或者消失等凋亡特征。
　　3.CPT誘導

9、破骨細胞早期凋亡凋亡Annexin V–FITC熒光染色，熒光顯微鏡下觀察到不同濃度 CPT作用于破骨細胞后典型的早期凋亡特征，CPT誘導破骨細胞凋亡呈現(xiàn)一定的時間-濃度依賴性。
　　4.CPT對破骨細胞CPT相關受體mRNA表達的影響：DR4、DR5、DcR1及 DcR2在破骨細胞上均有表達。經100ng/ml、500ng/mlCPT處理破骨細胞24h，CPT的相關受體DR4、DR5、DcR1及DcR2的mRNA表達水平變化不顯

10、著（P>0.05）；處理48h后， DR4和DcR2的mRNA表達水平仍無顯著變化（P>0.05），DR5及DcR1的mRNA表達水平下調（P<0.05或P<0.01）。推斷CPT是通過DR5誘導破骨細胞凋亡。
　　結論：
　　1.可以由人PBMC誘導形成的具有骨吸收活性的破骨細胞。
　　2.CPT可誘導人外周血源的破骨細胞發(fā)生凋亡。其誘導作用呈時間及濃度依賴性。
　　3.CPT作用破骨細胞一定時間后可降低DR5