蛙皮素與死亡素雜合抗菌肽在大腸桿菌中的融合表達(dá).pdf

1、抗菌肽作為生物免疫系統(tǒng)的主要組成部分，是生物體的免疫作用產(chǎn)生的抗菌譜廣、難以產(chǎn)生耐藥性的一類帶正電荷的兩親性小分子多肽。目前在醫(yī)藥、食品及畜牧業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。
　　將兩種或多種抗菌肽片段雜合形成一種新型的雜合肽，能夠彌補(bǔ)天然抗菌肽的缺點(diǎn)，增加抗菌肽的抑菌活性。本研究將蛙皮素抗菌肽與死亡素抗菌肽的有效作用部位拼接，獲得新型的雜合肽MT。根據(jù)雜合抗菌肽MT基因與大腸桿菌密碼子的偏好性設(shè)計(jì)了該雜合肽的基因序列，對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析

2、；利用SOE-PCR技術(shù)設(shè)計(jì)了三段引物，經(jīng)過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增獲得目的基因MT，將目的基因克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pGEX-6P-1構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-6P-1-MT；將構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株E.coli BL21（DE3）中構(gòu)建了基因工程菌pGEX-6P-1-MT/BL21（DE3），通過(guò)對(duì)IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、溫度以及培養(yǎng)基等發(fā)酵條件的優(yōu)化，利用GST瓊脂糖凝膠層析柱對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，腸激酶裂解后對(duì)雜合抗菌肽的抑菌活性

3、進(jìn)行初步分析。
　　本論文研究結(jié)果如下：
　?。?）生物信息學(xué)手段對(duì)雜合抗菌肽MT的理化參數(shù)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性等進(jìn)行預(yù)測(cè)得出：氨基酸總數(shù)為29，分子量大小為3.35kDa，等電點(diǎn)pI為10.57，含有α螺旋與β折疊結(jié)構(gòu)，親水性圖譜結(jié)果顯示該雜合肽具有兩親性，具有抗菌潛力。根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，優(yōu)化了該基因序列，最終得到具有抗菌潛力的目的基因MT序列。
　?。?）利用重疊延伸擴(kuò)增（SOE-PCR）技術(shù)，用合成的三段引

4、物通過(guò)兩輪PCR成功合成了雜合抗菌肽MT的基因。
　?。?）目的基因MT與表達(dá)載體pGEX-6P-1用EcoR I和BamH I雙酶切，然后進(jìn)行重組載體的構(gòu)建，成功獲得了重組表達(dá)載體pGEX-6P-1-MT。
　　（4）超聲破碎細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，融合蛋白以可溶形式存在于菌體上清，Western-blot證明目的蛋白表達(dá)，用GST瓊脂糖凝膠純化柱對(duì)雜合肽純化，純化后獲得融合蛋白，占菌體總量的50.1％，蛋白的表

5、達(dá)量為49.5mg/L，腸激酶切割后得到分子量為3.35kDa大小的MT目的蛋白。
　?。?）通過(guò)對(duì)雜合抗菌肽MT工程菌誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，獲得了雜合抗菌肽MT工程菌的優(yōu)化后條件分別為：IPTG濃度0.8mM；誘導(dǎo)時(shí)間3h；誘導(dǎo)溫度37℃；TB培養(yǎng)基。
　?。?）采用抑菌圈法對(duì)雜合抗菌肽MT的抑菌活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該雜合肽對(duì)大腸桿菌DH5α、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有抑制作用，抑菌圈大小分別為5mm、6mm和10mm，