水稻OsVDAC3的功能分析及互作蛋白的篩選.pdf

1、電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion channel，VDAC）蛋白是線粒體外膜孔狀蛋白，具有多種重要的生理生化功能。本實驗室在水稻日本晴基因組中鑒定了8個osvdac基因，但多數(shù)的功能仍不清楚。
　　本文為了研究osvdac3功能，構(gòu)建了水稻osvdac3植物RNA干涉載體，遺傳轉(zhuǎn)化得到陽性轉(zhuǎn)基因植株；對已經(jīng)得到的pCAMBIA1302-osvdac3超表達載體遺傳轉(zhuǎn)化的T1代植株進行非生物脅迫實

2、驗；另外，構(gòu)建膜蛋白酵母雙雜誘餌蛋白載體篩選水稻膜系統(tǒng)cDNA文庫中與OsVDAC3相互作用的蛋白。綜合分析，得到的主要結(jié)果如下：
　　1、根據(jù)osvdac3基因的ORF設計特異性干涉引物，將其克隆到植物干涉雙元載體pMCG161中，構(gòu)建了pMCG161-osvdac3干涉載體，以水稻日本晴為受體由農(nóng)桿菌介導進行遺傳轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，通過檢測引物PMCG3F/3R和PMCG2F/2R對轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA特異性擴增鑒定，得到了6株

3、RNA干涉陽性轉(zhuǎn)基因植株。RT-PCR結(jié)果表明，4株轉(zhuǎn)基因陽性植株中osvdac3基因表達量是轉(zhuǎn)基因陰性植株20-50％。
　　2、以轉(zhuǎn)入植物超表達載體的T1代轉(zhuǎn)基因植株幼苗為材料，RT-PCR檢測超表達植株osvdac3基因的表達量，并對超表達陽性幼苗進行鹽和甘露醇脅迫實驗。結(jié)果顯示超表達的osvdac3在鹽脅迫中促進了根的伸長，在甘露醇脅迫中促進了苗和根的伸長，推測osvdac3能提高水稻對鹽和干旱的雙重抗性。
　　3、

4、構(gòu)建膜蛋白酵母雙雜交誘餌蛋白載體pBT3-N-osvdac3ORF&pBT3-SUC-osvdac3 ORF，通過酵母雙雜交實驗，判斷出osvdac3的N端位于細胞質(zhì)內(nèi)，C端位于細胞質(zhì)外，因此確定pBT3-N-osvdac3ORF作為誘餌蛋白載體，并摸索得出3-AT濃度為7.5 mmol/L時嚴謹性最佳。以pBT3-N-osvdac3ORF篩選水稻YTB幼穗膜系統(tǒng)cDNA文庫，以及菌落轉(zhuǎn)移過濾染色實驗，鑒定出了3個與OsVDAC3相互作