PAK4激酶抑制劑CZh20抑制肺腺癌細胞增殖及侵襲作用機制的研究.pdf

1、目的：
　　腫瘤作為人類健康的主要殺手，其防治機制被廣泛關注。研究表明，腫瘤在本質上是種基因病，它的發(fā)生發(fā)展涉及到一個眾多調控因素發(fā)生改變的復雜演變過程，伴隨著原癌基因、抑癌基因、凋亡調控基因和相關修復基因等的突變由量變到質變過程的發(fā)生而發(fā)生發(fā)展。在這一過程中，相關的激酶信號通路發(fā)揮著重要作用，對激酶信號通路進行深入研究，可為防治腫瘤提供分子靶點，為抗腫瘤藥物的研究提供研發(fā)策略。
　　p21蛋白激活激酶(p21-activa

2、ted kinase，PAK)，為進化上比較保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可被Rho家族小烏苷三磷酸酶(Rho-GTPase) Cdc42/Rac1活化，在細胞信號通路和細胞生長過程中發(fā)揮重要作用。當PAKs被生長因子及其他胞外信號活化后，可通過一系列下游結合蛋白或磷酸化底物，發(fā)揮眾多生物學功能。PAK通過依賴GTP酶或不依賴GTP酶的信號通路調節(jié)基因的轉錄、細胞的增殖、細胞的凋亡、細胞骨架重組等，在細胞的惡性轉化和腫瘤細胞侵襲、轉移過

3、程中發(fā)揮了重要作用，因此被作為腫瘤防治的新的分子靶點。迄今研究表明，哺乳動物中PAK家族共有6個成員，根據(jù)結構及活化方式的不同，可將它們分為兩類，Ⅰ類包括PAK1，PAK2及PAK3;Ⅱ類包括PAK4，PAK5和PAK6。相對其他家族成員，PAK4研究得較為深入，目前發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤細胞中存在過表達、基因擴增及突變等，可通過多條信號通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，針對PAK4激酶的靶向治療對腫瘤的防治尤為重要。目前國際上針對其為靶點的抑制劑研究

4、處于起步階段，尚未開發(fā)出針對該靶點的有效的臨床藥物。
　　KY04031是PAK4激酶的小分子抑制劑，是一種ATP競爭性抑制劑，雖然其活性相對較弱，但其結構比較新穎，在整個激酶家族中選擇性較強，所以我們與沈陽藥科大學合作，在化合物KY04031的基礎上，保留吲唑和色胺側鏈部分，改構得到一系列化合物，對它們的激酶活性進行了高通量的篩選，并進一步對其中激酶抑制作用較為顯著的CZh20對肺腺癌細胞增殖侵襲等生物學行為的影響進行了較為深入

5、的研究。
　　本研究通過HTRF(@)(均相時間分辨熒光Homogeneous Time-ResolvedFluorescence)技術，發(fā)現(xiàn)了CZh20對PAK4激酶的抑制作用。驗證其對PAK4激酶活性的抑制作用，探究該化合物對肺腺癌細胞生物學功能的影響，為研究和開發(fā)新型抗腫瘤藥物提供依據(jù)。
　　方法：
　　一、探究CZh20對PAK4激酶活性的影響
　　用HTRF(@)（均相時間分辨熒光Homogeneous

6、 Time-Resolved Fluorescence）技術探究CZh20對PAK4激酶活性的影響。
　　二、CZh20對肺腺癌細胞A549增殖的影響及其作用機制的研究
　　1、MTT比色法研究CZh20對細胞增殖的影響。
　　2、流式細胞術研究CZh20對肺腺癌細胞A549細胞周期的影響。
　　3、Western Blot方法探究CZh20對周期相關蛋白Cylin D1，Cyclin D3，CDK2，CDK4，

7、CDK6和p21Cip1/Waf1表達水平的影響。
　　三、探究CZh0對肺腺癌A549細胞增殖的影響是否依賴于PAK4激酶活性
　　1、MTT比色法研究CZh20對細胞增殖的影響是否與PAK4激酶活性有關。
　　2、Western Blot方法檢測CZh20對周期相關蛋白的影響是否與PAK4激酶活性有關。
　　四、探究CZh20對肺癌細胞早期凋亡的影響
　　利用ANNEXIN-Ⅴ-FITC試劑盒探究CZh

8、20對肺腺癌A549細胞早期凋亡的影響。
　　五、探究CZh20對肺腺癌A549細胞侵襲轉移的影響及作用機制
　　1、Transwell實驗研究CZh20對肺腺癌細胞遷移及侵襲能力的影響。
　　2、Western Blot研究CZh20對LIMK1p-Thr508等細胞侵襲轉移相關蛋白表達水平的影響。
　　3、Western Blot方法探究CZh20對LIMK1 p-Thr508等蛋白表達的影響是否與PAK4激

9、酶活性相關。
　　結果：
　　一、CZh20抑制PAK4激酶活性
　　CZh20顯著抑制PAK4激酶活性。
　　二、CZh20影響GrS期轉化進而影響肺腺癌A549細胞的增殖
　　1、CZh20對A549細胞的增殖具有抑制作用。
　　2、CZh20增加了A549細胞周期中G1期細胞含量，降低了S期細胞的含量。
　　3、在A549細胞中，CZh20抑制周期相關蛋白Cyclin D1，Cyclh D

10、3，CDK2，CDK4和CDK6蛋白的表達，促進p21Cip1/Waf1蛋白的表達。
　　三、CZh20對A549細胞增殖的影響與PAK4激酶活性相關
　　1、MTT比色法實驗結果表明，CZh20對細胞增殖的抑制作用與PAK4激酶活性的強弱有關。
　　2、CZh20對周期相關蛋白的下調作用是通過抑制PAK4激酶活性實現(xiàn)的。
　　四、CZh20對肺腺癌A549細胞的早期凋亡沒有影響
　　CZh20對A549細

11、胞的早期凋亡沒有影響。
　　五、CZh20抑制肺腺癌A549細胞的侵襲轉移能力且這種抑制作用與PAK4激酶活性相關
　　1、CZh20對A549細胞的遷移及侵襲能力有抑制作用。
　　2、CZh20下調A549細胞中遷移侵襲相關蛋白LIMK1p-Thr508的表達。
　　3、CZh20對A549細胞中遷移侵襲蛋白表達水平的抑制作用與PAK4激酶活性相關。
　　結論：
　　1、CZh20在細胞內抑制PAK

12、4的激酶活性。
　　2、CZh20可阻滯A549細胞G1/S期的轉化，抑制A549細胞的增殖。
　　3、CZh20對周期相關蛋白CyclinD1，CyclinD3，CDK2，CDK4和CDK6表達水平的下調作用及對蛋白p21Cip1/Waf1表達水平的上調作用，均與PAK4激酶活性相關。
　　4、CZh20對A549細胞的早期凋亡沒有影響。
　　5、CZh20對肺腺癌細胞遷移及侵襲能力的抑制作用與PAK4/LIM