CRISPR-Cas9介導(dǎo)的丹參基因組編輯與丹參酮合成路徑的研究.pdf

1、中藥丹參來(lái)源于唇形科多年生的草本藥用植物丹參Salvia miltiorrhizaBunge的干燥根和根莖。廣泛分布于中國(guó)各地，種質(zhì)資源豐富。丹參藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有祛瘀止痛、通經(jīng)活血、清心除煩的功效，被用于治療心絞痛、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、瘀血腹痛等疾病。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其在保護(hù)心肌、擴(kuò)張血管、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血栓、保肝及抗菌消炎方面有明顯療效。丹參中主要有效成分是脂溶性的丹參酮類(lèi)和水溶性酚酸類(lèi)化合物，包括丹參酮I、丹參

2、酮IIA、丹參酮IIB、隱丹參酮、丹參素、丹酚酸等。丹參酮類(lèi)化合物是二萜醌結(jié)構(gòu)，是類(lèi)異戊二烯代謝途徑產(chǎn)生的，前體物質(zhì)是牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（Geranylgeranyldiphosphate,GGPP），但其下游合成通路的很多基因的功能尚不清楚。因此，如何挖掘這些基因的功能非常重要。
　　近年來(lái)，一種有效的基因敲除工具CRISPR（clustered regulatory interspaced short palindromi

3、c repeats）/Cas9（CRISPR associated protein9）的出現(xiàn)，為基因功能研究提供了很大助力。它可以利用一小段RNA作為引導(dǎo)，特異性識(shí)別靶向序列，再用核酸內(nèi)切酶Cas9對(duì)靶向序列進(jìn)行酶切，破壞其DNA結(jié)構(gòu)。針對(duì)不同的基因序列，只需要改變引導(dǎo)RNA的序列就可以成功實(shí)現(xiàn)基因編輯。相比于ZFNs和TALEN，CRISPR/Cas9構(gòu)建簡(jiǎn)單，打靶特異性高?？梢灶A(yù)見(jiàn)到CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯將在未來(lái)繼續(xù)

4、加快功能基因組學(xué)的研究步伐。本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9方法敲除丹參酮合成途徑的關(guān)鍵基因，獲得了丹參酮缺陷型丹參游離毛狀根突變體，通過(guò)研究突變體的次生代謝變化，進(jìn)而闡釋基因功能。
　　為了獲得丹參游離毛狀根突變體，在丹參基因組序列上設(shè)計(jì)了相應(yīng)的CRISPR/Cas9敲除靶點(diǎn)。被靶向的基因如下：SmCPS1、SmCPS2、SmCPS4、SmP1D10、SmCYP76AH1、SmCYP76AH3、SmCYP76AK1、SmCYP7

5、6AK3、Sm3383、Sm4361。利用變性銀染聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法檢測(cè)靶向序列DNA條帶，初步鑒定游離毛狀根突變體。通過(guò)直接測(cè)序和TA克隆后測(cè)序，鑒定了毛狀根突變體的基因型。已經(jīng)成功地獲得了SmCPS1和SmCYP76AH1的丹參毛狀根突變體株系，發(fā)現(xiàn)SmCPS1突變體的根表皮顏色與野生型相比發(fā)生了變化。為了提高CRISPR/Cas9的打靶效率，對(duì)所用CRISPR/Cas9載體做了丹參密碼子優(yōu)化的嘗試。
　　采用UPLC-

6、ESI-qTOF-MS檢測(cè)丹參游離毛狀根突變體的代謝產(chǎn)物變化，通過(guò)與野生型丹參毛狀根的代謝產(chǎn)物的EIC和TIC圖譜對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在SmCPS1的純合毛狀根突變體內(nèi)完全檢測(cè)不到三種主要丹參酮類(lèi)化合物（丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮）的含量，而嵌合突變體中這三種主要丹參酮類(lèi)化合物的含量均有大幅度的下降，再次證明了SmCPS1是丹參酮合成通路中的關(guān)鍵基因。
　　本研究建立了CRISPR/Cas9-突變體-代謝分析-基因功能闡釋的方法體系，即