非B細(xì)胞來(lái)源Igκ保守序列特異性抗體應(yīng)用的初步研究與ECDI交聯(lián)的人脾淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)供者特異性耐受的實(shí)驗(yàn)體系初步建立.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 非B細(xì)胞來(lái)源Igκ保守序列特異性抗體應(yīng)用的初步研究
　　傳統(tǒng)免疫球蛋白(Ig)是由B淋巴細(xì)胞接受抗原刺激后增殖分化為漿細(xì)胞所分泌的重要的免疫分子，兩種表現(xiàn)形式分別為分泌型與膜型。分泌型Ig主要是以抗體形式存在體液中，特異性結(jié)合相應(yīng)的抗原發(fā)揮多種免疫功能，因此，在特異性體液免疫中發(fā)揮重要作用;膜型Ig是以B細(xì)胞抗原受體(BCR)的形式存在B細(xì)胞表面，對(duì)于細(xì)胞活化、抗原識(shí)別、分化及

2、程序性細(xì)胞死亡中起重要作用。
　　目前的免疫學(xué)理論認(rèn)為在正常的機(jī)體內(nèi)，免疫球蛋白基因僅在B淋巴細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中選擇性進(jìn)行重組，而該基因在其它體細(xì)胞中處于胚系狀態(tài)，是B淋巴細(xì)胞的特征性產(chǎn)物。但是，關(guān)于非B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生Ig分子的現(xiàn)象逐漸被國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)可。2003年北京大學(xué)邱曉彥教授首次發(fā)現(xiàn)上皮來(lái)源腫瘤細(xì)胞（非淋巴性腫瘤）及部分增生正常上皮細(xì)胞可產(chǎn)生Ig。邱曉彥教授課題組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該Ig可能具有生長(zhǎng)因子樣活性，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)以及增殖有重要

3、的作用，并且發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞產(chǎn)生的Ig分子基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及結(jié)構(gòu)與來(lái)源B淋巴細(xì)胞的Ig典型特征完全不同。
　　B淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生多種不同特異性的Ig來(lái)應(yīng)對(duì)多種抗原。理論認(rèn)為，Ig是以可變區(qū)（V區(qū)）結(jié)合相應(yīng)抗原，因而V區(qū)的多樣性是保證應(yīng)對(duì)、識(shí)別或結(jié)合理論所有抗原的基礎(chǔ)。免疫球蛋白Ig由胚系基因編碼，而基因片段需要基因重排成為功能性編碼基因。Ig可變區(qū)的多樣性來(lái)源于B淋巴細(xì)胞中基因組發(fā)生重排組合以及連接與抗原刺激后誘發(fā)的B淋巴細(xì)胞高頻突變。

4、傳統(tǒng)免疫學(xué)理論認(rèn)為，Ig只在B淋巴細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中選擇性重排。邱曉彥教授課題組研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌、肺癌、卵巢癌、腸癌、胃癌、鼻咽癌、胰腺癌等上皮來(lái)源腫瘤細(xì)胞及部分正常上皮細(xì)胞內(nèi)Ig存在功能性基因重排。不同類型的腫瘤細(xì)胞表達(dá)完全相同的可變區(qū)序列，同一個(gè)體以及不同個(gè)體腫瘤細(xì)胞來(lái)源的Ig序列表達(dá)高度同源，研究發(fā)現(xiàn)在B細(xì)胞表達(dá)的Ig數(shù)據(jù)庫(kù)均未發(fā)現(xiàn)這些序列，提示Ig為非B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，來(lái)源于腫瘤細(xì)胞。腫瘤來(lái)源的Ig基因轉(zhuǎn)錄本具有獨(dú)特基因結(jié)構(gòu)，在不同類型

5、的腫瘤細(xì)胞，尤其是輕鏈在所有檢測(cè)病例均表達(dá)極為相似的重排模式（個(gè)別堿基的替換）或同一結(jié)構(gòu)保守序列，即Vκ4-1-Jκ3型Ig轉(zhuǎn)錄本。
　　考慮到Vκ4-1-Jκ3型Igs最初發(fā)現(xiàn)于腫瘤，因此可能成為腫瘤研究、診斷乃至治療的靶點(diǎn)，關(guān)鍵在于獲得針對(duì)Vκ4-1-Jκ3結(jié)構(gòu)特異性抗體。作為與北京大學(xué)邱曉彥教授的合作課題，課題組前期利用生物信息學(xué)方法分析預(yù)測(cè)了Vκ4-1-Jκ3型Ig兩個(gè)特異性的B細(xì)胞識(shí)別表位，設(shè)計(jì)合成三個(gè)短肽，分別為QF2

6、0(QAEDVAVYYCQQYYDTPVTF), AL13(序列 ASINCKSSQRVSL), AL13B(TQSPDSLVVSLGERASINCKSSQRVSLG，即AL13的延長(zhǎng)序列)，并獲贈(zèng)邱曉彥教授課題組提供的原核表達(dá)Vκ4-1-Jκ3型Ig融合蛋白(GST-Vκ4-1-Jκ3)。以合成肽AL13B-KLH、原核蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3免疫小鼠獲得系列單克隆抗體。獲得的抗Vκ4-1-Jκ3型Ig特異性表位抗體，為研究非B

7、淋巴細(xì)胞、組織液以及血液中可溶性Vκ4-1-Jκ3型Ig表達(dá)提供強(qiáng)有效工具。
　　本項(xiàng)研究主要目的是對(duì)抗Vκ4-1-Jκ3型Ig特異性表位單抗的鑒定以及建立雙單抗夾心ELISA檢測(cè)體系及其應(yīng)用。我們用ELISA鑒定抗體的特異性，這部分工作主要是在課題組前期抗Vκ4-1-Jκ3型Ig單抗制備工作的繼續(xù)。Vκ4-1-Jκ3型Ig最早發(fā)現(xiàn)于上皮來(lái)源腫瘤細(xì)胞，擬建立雙單抗夾心ELISA檢測(cè)體系，檢測(cè)可溶性（分泌型）Vκ4-1-Jκ3型Ig

8、κ，觀察正常人與腫瘤病人血清中的Vκ4-1-Jκ3型Ig表達(dá)總量是否存在差異。
　　雙單抗夾心ELISA檢測(cè)Vκ4-1-Jκ3型Ig體系建立與應(yīng)用
　　抗Vκ4-1-Jκ3單抗特異性的鑒定 Vκ4-1-Jκ3型Ig早期發(fā)現(xiàn)來(lái)源于上皮性腫瘤，基本結(jié)構(gòu)與正常Ig相同。課題組前期采用原核蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3免疫小鼠獲得了單克隆抗體4E9與1A3;用合成肽AL13B-KLH免疫小鼠獲得單克隆抗體6G5、5D3與3H9.2。

9、采用辛酸硫酸銨沉淀法純化單抗，ELISA鑒定純化后的單抗以及生物素標(biāo)記單抗的特異性。結(jié)果顯示抗Vκ41-Jκ3型Ig單抗能特異性地與原核重組蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3結(jié)合，且與人IgG與鼠IgG并無(wú)交叉反應(yīng)。因此5種抗Vκ4-1-Jκ3型Ig單抗與生物素標(biāo)記單抗均可用于后續(xù)雙單抗夾心ELISA體系的建立。
　　雙單抗夾心ELISA檢測(cè)Vκ4-1-Jκ3型Ig體系建立本章工作的主要目的是建立雙單抗夾心ELISA檢測(cè)體系，并以此檢

10、測(cè)正常人與腫瘤患者可溶性Vκ4-1-Jκ3型Ig水平及表達(dá)規(guī)律。本課題組前期工作建立單多抗夾心ELISA檢測(cè)體系(1A3-標(biāo)準(zhǔn)血清-HRP-IgA，1A3-標(biāo)準(zhǔn)血清-HRP-IgG和1A3-標(biāo)血清-HRP-IgM)檢測(cè)顯示正常人血清與腫瘤患者血清Vκ4-1-Jκ3型Ig含量有明顯差別，表現(xiàn)為腫瘤患者血清中可溶性Vκ4-1-Jκ3型IgA與IgG含量顯著高于正常人;而Vκ4-1-Jκ3型IgM明顯低于正常人。在此基礎(chǔ)上，我們嘗試建立雙單抗

11、夾心ELISA體系檢測(cè)可溶性Vκ4-1-Jκ3型Ig，結(jié)果顯示雙單抗夾心ELISA體系可特異性結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品融合重組蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3，不能結(jié)合正常人血清與腫瘤血清Vκ4-1-Jκ3型Ig，未檢測(cè)血清與腫瘤病人血清Vκ4-1-Jκ3型Ig總量表達(dá)存在有差異。因此不能用此體系檢測(cè)腫瘤血清與正常血清Vκ4-1-Jκ3型Ig總量。
　　第二部分 ECDI交聯(lián)的人脾淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)供者特異性耐受的體系初步建立
　　ECDI即1-

12、（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺(1-ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)-carbodiimide），是一種易潮濕、水溶性的化學(xué)藥物，廣泛應(yīng)用于肽的合成。ECDI與肽和蛋白的偶聯(lián)主要是通過(guò)激活游離的羧基，促使激活的羧基與亞胺形成共價(jià)肽。1979年Miller等首次提出ECDI聯(lián)合抗原遞呈細(xì)胞APC具有誘導(dǎo)耐受的潛力并證實(shí)ECDI-APC會(huì)誘使效應(yīng)T細(xì)胞無(wú)能以及抗原特異性無(wú)反應(yīng)性。ECDI偶聯(lián)抗原在某些

13、在某些自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化，自身免疫性糖尿病，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎可誘導(dǎo)自身免疫耐受。
　　如何在移植患者體內(nèi)誘導(dǎo)供者特異性免疫耐受，從而最終避免排斥反應(yīng)，停用，甚至不用免疫抑制藥物是移植學(xué)研究的重要目標(biāo)之一。誘導(dǎo)供者特異性免疫耐受的策略之一是在移植前將供者抗原暴露于受體。此類暴露方法的最關(guān)鍵之處是確定暴露的具體條件，以確保誘導(dǎo)受體耐受而不是引起受體致敏。這種類似于“幼兒計(jì)劃免疫接種”的方法自從1980年代以來(lái)進(jìn)行了多次

14、實(shí)驗(yàn)，終因產(chǎn)生致敏和促血栓形成等多種因素被排除在臨床應(yīng)用之外。近期，有學(xué)者通過(guò)應(yīng)用一種ECDI把自身免疫疾病相關(guān)的肽或蛋白交聯(lián)到脾細(xì)胞，并輸注至自身免疫疾病動(dòng)物模型，成功在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎(EAE)和自身免疫性糖尿病(T1D)模型誘導(dǎo)抗原耐受。
　　Xunrong Luo首次把這種策略轉(zhuǎn)換到移植耐受領(lǐng)域，通過(guò)輸注ECDI處理的供者脾細(xì)胞(ECDI-SPs)，在MHC完全錯(cuò)配的小鼠胰島移植中成功誘導(dǎo)胰島移植物的無(wú)限期存活。該研究

15、方案基于完全不用免疫抑制劑，不需要短暫細(xì)胞刪除、抗體介導(dǎo)的共刺激信號(hào)阻斷、或移植前應(yīng)用免疫抑制藥物等措施。進(jìn)一步研究顯示ECDI-SPs輸注通過(guò)多種機(jī)制來(lái)影響宿主異基因反應(yīng)，包括克隆清除、無(wú)能和免疫調(diào)節(jié)，這些機(jī)制通過(guò)協(xié)同作用來(lái)誘導(dǎo)高效的移植免疫耐受。除在小鼠同種異體和異種異體的胰島細(xì)胞移植模型中觀察到ECDI-SPs可誘導(dǎo)長(zhǎng)期移植耐受，并且，在輸注前刪除B細(xì)胞可有效誘導(dǎo)出異種胰島移植物的無(wú)限期存活。研究還顯示ECDI-SPs可顯著延長(zhǎng)在

16、MHC完全錯(cuò)配的心臟移植物的存活，并且，短期應(yīng)用雷帕霉素(rapamycin)可誘導(dǎo)受體心臟移植物無(wú)限期存活。
　　目前工作擬在前期研究工作的基礎(chǔ)上，通過(guò)體外混合淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，與輸注人類脾淋巴細(xì)胞至NOD-SCID小鼠（即重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠，T和B細(xì)胞缺陷）建立人源化小鼠模型進(jìn)行ECDI-SPs體內(nèi)實(shí)驗(yàn)闡明ECDI-SPs誘導(dǎo)下人淋巴細(xì)胞各亞群異基因反應(yīng)性的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律和機(jī)制;研究模擬同種異基因移植環(huán)境下，人類ECDI-SPs誘

17、導(dǎo)人淋巴細(xì)胞抗原特異性免疫耐受的效果，深入探討針對(duì)供者特異性免疫耐受機(jī)制。
　　ECDI-SPs誘導(dǎo)供者特異性耐受體系的建立
　　初步研究人類ECDI-SPs誘導(dǎo)異基因T淋巴細(xì)胞各亞群的活化、增殖、凋亡的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律主要采用混合淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行流式檢測(cè)觀察ECDI-SPs在體外對(duì)受者淋巴細(xì)胞的影響，包括增殖，抑制增殖與凋亡的變化規(guī)律。研究結(jié)果顯示ECDI-SPs誘導(dǎo)方案顯示可特異性抑制T細(xì)胞亞群的增殖。ECDI可誘導(dǎo)其處理的