桑樹DREB基因家族生物信息學分析及功能研究.pdf

1、自然條件下，植物在整個生命周期中經常遇到多種脅迫，其中干旱、高溫、低溫和高鹽等非生物脅迫是影響和限制植物生長發(fā)育的主要因子，甚至會導致植物的死亡，從而嚴重影響農林業(yè)生產效益。因此，非生物脅迫響應的相關基因研究具有重要理論和現實意義。
　　 轉錄因子作為基因上游的調控因子，在植物的抗逆性方面起著重要作用，其可以激活多種脅迫相關的調控及功能基因的表達，在提高植物抗逆性方面比單一的功能基因更為有效。目前，植物中研究的比較多的逆境相關的

2、轉錄因子主要有MYB、WRKY、bZIP、AP2/ERF和NAC五大類。AP2/ERF類轉錄因子作為與脅迫相關的一大類轉錄因子，根據其結構特點又分為AP2、ERF、DREB、RAV和其他等五個亞家族，其中DREB(Dehydrationresponsiveelementbinding)類轉錄因子是AP2/ERF家族中與干旱、高溫、低溫等逆境脅迫相關的植物特有的一類轉錄因子，其可以特異的與DRE(Dehydrationrespossive

3、element)元件相結合，調控啟動子中含有DRE元件的基因的表達，能整體性的提高植物的抗逆性，因此，DREB類轉錄因子的研究受到廣泛的關注。但是，目前關于DREB類轉錄因子的研究主要集中在草本植物中，而在木本植物的研究鮮有報導。
　　 桑樹(MorusL.)屬多年生雙子葉木本植物，從南緯10°到北緯50°都有分布。我國是世界桑樹的主要起源地，是世界上桑種質資源最多的國家。桑樹對脆弱環(huán)境的抗逆性極強，具有耐澇、耐干旱、耐貧瘠、發(fā)

4、根力強、生長迅速等特點，且桑葉對二氧化硫、氟化氫、氯氣等污染物有很強的耐受性和吸收凈化能力，是一種優(yōu)良的生態(tài)經濟樹種。但是，目前關于桑樹抗逆性方面的研究并不多見，關于桑樹DREB轉錄因子的研究更是未見報道，因此，對桑樹中DREB類轉錄因子的研究將有助于補充完善DREB類轉錄因子在木本植物研究的不足，進一步探究和完善DREB類轉錄因子的逆境調控機理。本研究通過生物信息學的方法對川?；蚪M數據中的30條DREB蛋白序列進行序列分析、克隆，并

5、以湖桑為材料對其中的20個基因進行了高溫、低溫、干旱和高鹽脅迫四種脅迫誘導表達分析，對響應干旱和高鹽的基因MnDREB4G進行克隆，構建表達載體并轉化到擬南芥中進行功能研究。本研究的主要結果如下:
　　 1.川桑DREB基因家族生物信息學分析
　　 采用生物信息學分析方法，從川桑數據庫中分析得到110個含有AP2結構域的蛋白序列，其中AP2家族17個，RAV家族3個，ERF家族54個，DREB家族30個，其他類6個。根據

6、AP2保守結構域的序列特征，川桑DREB家族又分為6個組，其中A1-A6組所含基因個數為2、5、2、8、8、5，其各個組基因的分布情況與擬南芥相類似。其蛋白的分子量多在20-30KD，等電點在4.78到8.93之間?；蜷L度多在1000bp以下，并且除了第二組的MnDREB2B，MnDREB2C，和MnDREB2E為多外顯子基因外，其他27個基因均為單外顯子，這一情況與水稻中的第二組的基因結構存在類似情況，推測川桑第二組的這三個基因也可

7、能存在選擇性剪切機制。對上游啟動子序列分析發(fā)現，川桑DREB基因上游的啟動子序列中含有多種脅迫相關的元件。由轉錄組數據分析發(fā)現，30個DREB基因中的27個基因在轉錄組中存在表達數據，各個組內的基因間表達模式不盡相同，如第六組的MnDREB6B在轉錄組數據中表達量最高，但是MnDREB6E在各個組織中卻很低。
　　 2.桑樹DREB基因脅迫誘導表達分析
　　 以川桑DREB基因序列為依據設計RT-PCR引物，從湖桑cDN

8、A中篩選得到20對可用引物，對篩選得到的對應的20個基因進行高溫、低溫、干旱、高鹽脅迫處理，發(fā)現不同組基因對不同脅迫具有不同的響應，且與其上游啟動子序列中含有的脅迫元件不存在必然的關系。推測川桑中由DREB轉錄因子介導的對非生物脅迫的響應機制可能更為復雜，需要多個基因的相互作用，也可能是川桑中的啟動子序列與湖桑中對應的啟動子序列存在差異，以湖桑為材料進行的脅迫處理結果不能完全代表川桑中相應基因對脅迫的響應機制。
　　 3.MnD

9、REB4G的功能研究
　　 成功構建MnDREB4G轉基因擬南芥株系，對14號、29號、32號轉基因株系中的脅迫相關的下游基因rd17、LEA14和rd29A的表達量進行分析發(fā)現，rd17和rd29A基因在轉基因擬南芥中的表達量上調，且和目的基因MnDREB4G的表達模式相一致，表明MnDREB4G基因對rd17和rd29A的表達起到促進作用，且促進作用與MnDREB4G基因的表達量成正相關;而LEA14基因的表達量在轉基因擬南