大豆GmTOCls和GmLCLs的基因克隆、表達(dá)模式及功能分析.pdf

1、擬南芥生物鐘系統(tǒng)的中央振蕩器主要有三個(gè)重要組分：即CCAI(CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATEDI),LHY(LATE ELONGATEDHYPOCOTYL)和TOCI(TIMING OF CAB EXPRESSIOVI).CCAI瓢LHY各編碼MYB相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，TOCI是一個(gè)偽反應(yīng)調(diào)節(jié)因子(PSEUDO-RESPONSE REGULATOR)。凌晨時(shí)，CCA1和LHY的轉(zhuǎn)錄達(dá)到高峰，其蛋白結(jié)合在TOCI啟動(dòng)子的夜晚

2、元件(Evening element，EE)上協(xié)同抑制TOCI的轉(zhuǎn)錄。而在暗中，TOCI表達(dá)逐漸升高并在深夜選到高峰，高表達(dá)的TOCI通過(guò)一種未知的機(jī)制促進(jìn)CCAI和LHY的表達(dá)并使其在凌晨達(dá)到高峰，三者形成一個(gè)反饋抑制環(huán)(Feedback loop)，并有節(jié)律的振蕩。
　　 大豆是典型的短日植物，又是古四倍體，因此，研究大豆生物鐘成分LHY/CCAI/TOC1，闡明其功能，對(duì)揭示大豆光周期調(diào)節(jié)及植物生物鐘系統(tǒng)的進(jìn)化和多樣性具有

3、重要意義。
　　 本研究從大豆KN18中克隆得到的四個(gè)TOC1同源物及其啟動(dòng)子，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，大豆GmTOC1s與AtTOCI位于同一進(jìn)化枝，表明它們之間的親緣關(guān)系較近。從內(nèi)含子-外顯子比對(duì)分析結(jié)果可以看出，GmTOC1的四個(gè)拷貝與AtTOC1同源性較高；進(jìn)一步的氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)．GmTOC1的四個(gè)拷貝及AtTOC1分別有二個(gè)外顯子同時(shí)編碼保守的調(diào)節(jié)區(qū)域，一個(gè)外顯子都編碼保守的CCT區(qū)域。由此可見(jiàn)，GmTOCi與At

4、TOC1可能具有相似的功能。
　　 對(duì)大豆四個(gè)TOC1同源物的啟動(dòng)子進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)四個(gè)啟動(dòng)子都具有受光誘導(dǎo)、激素誘導(dǎo)和脅迫誘導(dǎo)等順式作用元件，而且和擬南芥AtTOC1啟動(dòng)于相比較，各類元件又具有各自的特異性；分析EE元件，發(fā)現(xiàn)在擬南芥AtTOC1和大豆GmTOC1-3的啟動(dòng)子中都具有完整的夜晚元件AAAATATCT，在大豆TOC1同源物的其他啟動(dòng)子中不具有完整的EE元件，但含有AAAATATNN元件，初步推測(cè)可能在進(jìn)化

5、過(guò)程中發(fā)生了EE元件后兩個(gè)堿基的突變，但并不影響其正常功能。
　　 本研究還克隆到大豆GmLCL(Glycine max L．LHY and CCA1 Like)基因的四個(gè)拷貝，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，用實(shí)時(shí)定量PCR(QuantitativeReal-time RT-PCR)分析丁其在不同組織器官和發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)模式，并將部分基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)研究其功能。．主要研究結(jié)果如下：
　　 1．大豆GmLCLs基因均具

6、有保守的MYB DNA結(jié)合域，在MYB DNA結(jié)合域上游都具有保守的絲氨酸位點(diǎn);
　　 2．GmLCL1，GmLCL2，GmLCL3和GmLCL4 mRNA表達(dá)，除開(kāi)花期外，大多在其他發(fā)育時(shí)期的葉片中高水平表達(dá)，初步推測(cè)GmLCLs在大豆發(fā)育的前期和中期具有重要功能；
　　 3．分析大豆GmLCLs總蛋白在不同發(fā)育時(shí)期和不同組織器官的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)具有與mRNA對(duì)應(yīng)的表達(dá)模式；
　　 4．長(zhǎng)日條件下，不同緯度來(lái)源