轉錄因子CREB靶向調節(jié)SKA2影響腎癌細胞的增殖.pdf

1、研究目的：
　　本研究探索CREB對腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)增殖中的影響，以及紡錘體與動粒相關復合物2(Spindle and kinetochore associated complex2，SKA2)在此過程中的作用。
　　實驗方法：
　　1.用QRT-PCR和蛋白印記(Western blot)檢測CREB在腎癌病人癌組織、癌旁組織及腎癌細胞系中的表達水平；2.利用RNA干擾(R

2、NAi)技術，瞬轉siCREB降低細胞內CREB的表達水平后，觀察其對細胞增殖的影響；3.用生物信息學分析和CHIP實驗探討SKA2是否為CREB的下游靶基因；4.用QRT-PCR和Western blot檢測SKA2在腎癌細胞系中的表達水平、降低SKA2的表達后對腎癌細胞增殖的影響、轉染CREB高表達質粒（pCI-neo/CREB）后，研究其是否逆轉 siSKA2調節(jié)的細胞增殖和細胞周期阻滯；5.設計針對 CREB的短發(fā)卡 RNA(s

3、hRNA)，通過慢病毒系統(tǒng)構建穩(wěn)定低表達CREB的OS-RC-2細胞系，觀察其對裸鼠皮下成瘤能力和瘤塊內 SKA2蛋白表達的影響；6.用QRT-PCR檢測腎癌組織及癌旁組織內SKA2的表達、用皮爾森相關分析法分析 CREB和 SKA2在組織中二者的相關性、最后用免疫組化法分析166例臨床標本中CREB和SKA2的蛋白表達及定位、并用斯皮爾曼相關分析法分析二者關系。
　　實驗結果：
　　(1)腎癌組織和細胞中CREB的表達水平

4、顯著性高于對照；
　　(2) siCREB降低細胞內CREB的表達后，顯著性抑制了腎癌細胞的增殖;
　　(3)細胞實驗發(fā)現(xiàn)，降低細胞內 CREB水平后伴隨著 SKA2蛋白表達的降低；此外，CHIP實驗也證實SKA2是CREB的靶基下游因；
　　(4)降低細胞內高表達的SKA2后，能顯著性抑制細胞的增殖；然而，高表達CREB后能逆轉siSKA2處理引起的細胞增殖抑制和細胞分裂中期停滯；
　　(5)裸鼠皮下注射攜帶有

5、低表達 CREB的腫瘤細胞后，瘤塊大小顯著性低于對照；此外，瘤塊組織內SKA2基因和蛋白的表達也被顯著性抑制；
　　(6)分析166例臨床組織標本發(fā)現(xiàn)，同一病人組織中SKA2和CREB的mRNA水平呈顯著性正相關；二者的染色強度都隨著腎癌分期惡性程度的增加而增加。
　　結論：
　　CREB在腎癌組織及細胞中高表達；降低細胞內CREB的表達可以在體內外抑制腫瘤細胞的生長，其機制是通過降低周期相關蛋白SKA2的表達；低表達