降鈣素基因相關(guān)肽對氧化損傷的小鼠成骨細(xì)胞的保護(hù)作用研究.pdf

1、機(jī)體在正常代謝中的不同階段均會(huì)產(chǎn)生或多或少的活性氧(Reactive oxygen species，ROS);當(dāng)機(jī)體遭受創(chuàng)傷時(shí)，自身抗氧化能力下降、ROS產(chǎn)生增多，同時(shí)機(jī)體自身防御機(jī)制啟動(dòng)，產(chǎn)生大量的IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子，當(dāng)ROS和各種炎癥因子同時(shí)作用于成骨細(xì)胞時(shí)，成骨細(xì)胞的增殖、分化水平降低，骨創(chuàng)傷愈合減緩，甚至停滯。骨創(chuàng)傷愈合是一個(gè)復(fù)雜的連續(xù)的病理生理過程，包括多種分子信號(hào)、細(xì)胞因子的參與。
　　有實(shí)驗(yàn)證

2、實(shí)，神經(jīng)系統(tǒng)參與骨重塑。在機(jī)體骨折或者其他外傷時(shí)，外周肽能神經(jīng)可以通過一些神經(jīng)肽影響破骨細(xì)胞的形成，進(jìn)而影響骨折或者其他外傷的愈合。降鈣素基因相關(guān)肽（Calcitonin gene-related peptide，CGRP）是一種由特定神經(jīng)元的可變剪接生成的37個(gè)氨基酸組成，是骨修復(fù)和發(fā)育過程中神經(jīng)纖維所表達(dá)的一種重要的神經(jīng)肽。
　　目的:
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CGRP在骨創(chuàng)傷愈合的過程中，部分通過促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化

3、來發(fā)揮其促進(jìn)修復(fù)作用，本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步證實(shí)是否有部分是通過保護(hù)成骨細(xì)胞氧化損傷來實(shí)現(xiàn)其促進(jìn)修復(fù)作用。
　　本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建小鼠成骨細(xì)胞的氧化損傷模型，通過對ROS的含量、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性以及炎癥因子白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α水平的檢測，來探索CGRP對小鼠成骨細(xì)胞的抗氧化損傷保護(hù)作

4、用及其相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　1.體外分離、培養(yǎng)、鑒定原代Balb/c小鼠成骨細(xì)胞。
　　2.在體外用過氧化氫(H2O2)構(gòu)建小鼠成骨細(xì)胞氧化損傷模型。
　　3.使用不同濃度的CGRP（10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mo l/L）預(yù)處理在體外培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞1h后，CCK(Cell counting kit)-8法檢測各組細(xì)胞活性并篩選優(yōu)勢濃度。
　　4.使用SOD試劑盒對H2O2

5、和CGRP處理后的小鼠成骨細(xì)胞進(jìn)行SOD活性檢測。
　　5.使用ROS試劑盒對H2O2和CGRP處理后的小鼠成骨細(xì)胞進(jìn)行ROS含量檢測。
　　6.使用小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α定量分析酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒檢測H2O2和CGRP處理后的小鼠成骨細(xì)胞。
　　結(jié)果:
　　1.成功分離并純化擴(kuò)增Balb/c小鼠成骨細(xì)胞。

6、>　　2.在體外小鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)基中加入H2O2，成功構(gòu)建小鼠成骨細(xì)胞氧化損傷模型。使用CCK-8法檢測細(xì)胞活性，小鼠成骨細(xì)胞在含不同濃度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5mol/L)H2O2的培養(yǎng)液的條件下培養(yǎng)12、24、36、48h后，當(dāng)培養(yǎng)液使用的是含10-4mol/L的H2O2培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的增殖活性開始受到抑制(P＜0.01)。
　　3.CCK-8法結(jié)果顯示，小鼠成骨細(xì)胞在含不同濃度(10-6、10-

7、7、10-8、10-9、10-10mol/L)CGRP的培養(yǎng)液的條件下預(yù)處理1h后，當(dāng)使用的培養(yǎng)液是含10-8mol/L的CGRP培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的增殖活性最高(P＜0.01)。
　　4.SOD試劑盒檢測結(jié)果提示，CGRP組SOD活性與空白對照組相比，明顯升高(P＜0.05);H2O2組SOD活性較空白對照組相比受到明顯抑制(P＜0.05);CGRP+H2O2組SOD活性相對于H2O2組是顯著升高的(P＜0.01)。
　　

8、5.ROS試劑盒檢測結(jié)果提示，H2O2處理后，ROS含量相對于對照組顯著增高(P＜0.01);先使用10-8mol/L CGRP預(yù)處理后再用H2O2處理，其ROS含量與單獨(dú)使用H2O2處理相比顯著降低(P＜0.01)。
　　6.小鼠IL-6、IL-1β、TNF-αELISA試劑盒結(jié)果提示，使用10-4mol/L H2O2的培養(yǎng)液處理后，小鼠成骨細(xì)胞IL-6、IL-1β、TNF-α分泌與空白對照組相比，明顯增高(P＜0.01);而預(yù)

9、處理使用含10-8mol/L CGRP的培養(yǎng)液后接著再使用H2O2處理，IL-6、IL-1β、TNF-α分泌水平相對于H2O2組明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.使用貼壁篩選手段可以成功的從Balb/c小鼠顱骨獲取所需要的成骨細(xì)胞
　　2.H2O2能夠成功構(gòu)建小鼠成骨細(xì)胞氧化損傷模型，H2O2對小鼠成骨細(xì)胞會(huì)造成氧化損傷
　　3.CGRP對小鼠成骨細(xì)胞具有促進(jìn)增殖，保護(hù)氧化損傷作用，其優(yōu)勢濃度為10