創(chuàng)面生物電場(chǎng)和缺氧微環(huán)境對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　本課題通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，研究燒傷創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中缺氧與細(xì)胞遷移的關(guān)系以及可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1.原代角質(zhì)形成細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
　　2.siRNA轉(zhuǎn)染
　　3.腺病毒轉(zhuǎn)染
　　4.材料制作
　　5.加電處理細(xì)胞
　　6.活細(xì)胞工作站檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力
　　7.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞側(cè)向遷移能力
　　8.Western blot
　　9.免疫熒光染色
　

2、　結(jié)果：
　　1.電場(chǎng)通過(guò)下調(diào)PTEN激活mTORC1而引起EMT，啟動(dòng)細(xì)胞遷移。
　　1.1 外加直流電場(chǎng)處理可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生EMT
　　Western Blot及免疫熒光染色顯示，外加直流電場(chǎng)處理可顯著增加Snail、Slug、N-cadherin、波形蛋白的表達(dá)水平，且這種促進(jìn)作用呈時(shí)間依賴性，說(shuō)明電場(chǎng)促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)換。
　　1.2 外加直流電場(chǎng)處理引起細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增加
　　電場(chǎng)處理可明顯

3、促進(jìn)單個(gè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)距離及軌跡速度;電場(chǎng)組細(xì)胞遷移面積大約是正常組2倍，說(shuō)明電場(chǎng)可顯著增加促進(jìn)單層細(xì)胞側(cè)向遷移。
　　1.3 外加直流電場(chǎng)處理抑制角質(zhì)形成細(xì)胞PTEN表達(dá)
　　正常細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)水平較高，電場(chǎng)可引起其表達(dá)下降，加電時(shí)間越長(zhǎng)，PTEN含量下降越明顯。
　　1.4 外加直流電場(chǎng)通過(guò)下調(diào)PTEN引起EMT
　　用siRNA下調(diào)PTEN表達(dá)水平后，在相同的電場(chǎng)處理?xiàng)l件下，該組中Snail、Slug、N

4、-cadherin、波形蛋白表達(dá)水平較單純加電細(xì)胞更高，E-cadherin表達(dá)水平更低，說(shuō)明降低電場(chǎng)處理時(shí)的PTEN水平可進(jìn)一步促進(jìn)EMT發(fā)生。用腺病毒過(guò)表達(dá)PTEN后，在相同的電場(chǎng)處理?xiàng)l件下，該組Snail、Slug、N-cadherin、波形蛋白表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin表達(dá)水平恢復(fù)，提示過(guò)表達(dá)PTEN可抑制EMT發(fā)生。
　　1.5 外加直流電場(chǎng)通過(guò)下調(diào)PTEN促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性
　　在相同的電場(chǎng)處理?xiàng)l件下，進(jìn)

5、一步下調(diào)PTEN后細(xì)胞運(yùn)動(dòng)范圍增加，平均運(yùn)動(dòng)距離及軌跡速度增大，過(guò)表達(dá)PTEN組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)范圍縮小，平均運(yùn)動(dòng)距離及軌跡速度降低;劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　1.6 外加直流電場(chǎng)可激活角質(zhì)形成細(xì)胞mTORC1通路
　　p-p70S6K和p-4E-BP1的表達(dá)水平隨著電場(chǎng)處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，呈時(shí)間依賴性，說(shuō)明電場(chǎng)處理可以激活mTORC1通路。
　　電場(chǎng)處理可激活mTORC1，加入siPTEN會(huì)進(jìn)一步引起mTORC1活化;R

6、apamycin可顯著抑制mTORC1活性，但不影響PTEN的表達(dá)水平，說(shuō)明PTEN可負(fù)向調(diào)控mTORC1的活性。
　　在相同的電場(chǎng)處理?xiàng)l件下，加入Rapamycin會(huì)抑制siPTEN對(duì)EMT的誘導(dǎo)，Snail、Slug、N-cadherin、波形蛋白表達(dá)水平下降，E-cadherin表達(dá)水平恢復(fù)，說(shuō)明PTEN下調(diào)誘導(dǎo)EMT時(shí)需要活化的mTORC1。
　　2.電場(chǎng)通過(guò)激活自噬促進(jìn)細(xì)胞定向遷移能力
　　2.1 外加直流電

7、場(chǎng)處理促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞定向遷移
　　正常情況下，細(xì)胞隨機(jī)向各個(gè)方向運(yùn)動(dòng)，無(wú)明顯的方向性，運(yùn)動(dòng)范圍較小。電場(chǎng)處理使細(xì)胞從正極向負(fù)極移動(dòng)，運(yùn)動(dòng)方向逐漸接近水平，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)范圍明顯增大，說(shuō)明外加直流電場(chǎng)處理可以促進(jìn)細(xì)胞定向遷移。
　　2.2 外加直流電場(chǎng)處理可增加細(xì)胞自噬水平
　　Western blot結(jié)果表明，電場(chǎng)可引起HaCaT和MKs細(xì)胞中自噬經(jīng)典標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ、p62表達(dá)增多，這種促進(jìn)作用呈時(shí)間依賴性。
　　

8、電鏡結(jié)果顯示，正常情況下細(xì)胞中自噬水平很低，電場(chǎng)刺激后自噬數(shù)目增加，多為單層膜結(jié)構(gòu)，是已經(jīng)成熟的自噬溶酶體，胞漿成分已部分或全部降解。
　　用GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后加電處理，發(fā)現(xiàn)正常情況下細(xì)胞中自噬水平很低，綠色熒光無(wú)點(diǎn)狀聚集，加電后胞漿中出現(xiàn)大量點(diǎn)狀綠色熒光，即自噬體。該結(jié)果與前述結(jié)果一致，說(shuō)明電場(chǎng)可增加細(xì)胞自噬水平。
　　用針對(duì)LC3的抗體通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞本身的內(nèi)源性蛋白，發(fā)現(xiàn)電場(chǎng)處理可以增加自噬水平。<

9、br>　　2.3 電場(chǎng)條件下細(xì)胞自噬流通暢
　　電場(chǎng)條件下，用ACTD處理細(xì)胞后，p62、LC3-Ⅱ表達(dá)水平降至與正常細(xì)胞中p62、LC3-Ⅱ表達(dá)量相等，說(shuō)明加電時(shí)p62、LC3-Ⅱ表達(dá)增高是由電場(chǎng)刺激基因轉(zhuǎn)錄、翻譯增加引起的。
　　電場(chǎng)條件下，與單純加電組相比，CQ和BafA1可引起p62、LC3-Ⅱ水平顯著升高，說(shuō)明加電時(shí)細(xì)胞自噬流通暢，抑制劑阻斷了降解過(guò)程的關(guān)鍵步驟，引起降解障礙，造成p62和LC3-Ⅱ堆積。
　

10、　用GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞并加電，發(fā)現(xiàn)紅色熒光和綠色熒光完全重疊，形成嫩黃色，說(shuō)明自噬體和溶酶體共定位好，提示二者融合無(wú)障礙，自噬流通暢。
　　電鏡發(fā)現(xiàn)加電后細(xì)胞中自噬多為單層膜結(jié)構(gòu)，是已經(jīng)成熟的自噬溶酶體，胞漿成分已部分或全部降解。說(shuō)明加電時(shí)自噬體和溶酶體融合成熟無(wú)障礙，融合后可順利降解底物，提示自噬流通暢。
　　2.4 敲除ATG5基因引起細(xì)胞自噬水平下降
　　在正常情況下，用siRNA敲減ATG5后，加電處

11、理不再引起siATG5細(xì)胞自噬水平增加，LC3下調(diào)，p62累積，說(shuō)明敲除ATG5可抑制電刺激對(duì)自噬的促進(jìn)作用。
　　2.5 電場(chǎng)條件下自噬促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞定向遷移
　　正常情況下，細(xì)胞向各個(gè)方向運(yùn)動(dòng)，無(wú)方向性，運(yùn)動(dòng)軌跡集中，運(yùn)動(dòng)范圍都比較小，電場(chǎng)處理可促進(jìn)細(xì)胞定向遷移。與加電組相比，敲除ATG5的細(xì)胞加電后仍可定向遷移，但運(yùn)動(dòng)范圍減小，軌跡速度、位移速度、X軸方向位移速度顯著下降，說(shuō)明外加直流電場(chǎng)處理通過(guò)自噬促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞

12、定向遷移能力。
　　3.缺氧通過(guò)抑制AMPK激活mTORC1而促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力
　　3.1 缺氧處理激活角質(zhì)形成細(xì)胞中mTORC1通路
　　Western blot結(jié)果顯示，MKs細(xì)胞缺氧3h、6h、12h后p-p70S6K和p-4EBP1表達(dá)水平均顯著上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。p70S6K、4EBP1總蛋白表達(dá)水平不受缺氧處理的影響。HaCaT細(xì)胞接受缺氧處理后亦出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。
　　正常情況下，p-p70S6K主要

13、分布在細(xì)胞核中，缺氧處理后熒光染色亮度增強(qiáng)，核中點(diǎn)狀陽(yáng)性染色增加，p-4EBP1染色得到相似的結(jié)果，說(shuō)明缺氧處理激活角質(zhì)形成細(xì)胞中mTORC1通路。
　　3.2 雷帕霉素處理抑制mTORC1活性
　　雷帕霉素可顯著抑制p-p70S6K、p-4EBP1表達(dá)量，與6h組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明雷帕霉素可完全抑制缺氧激活的mTORC1。
　　3.3 慢病毒干擾抑制mTORC1活性
　　敲減了Raptor的細(xì)胞接受缺氧處理后p

14、-p70S6K和p-4EBP1表達(dá)量無(wú)明顯變化，p70S6K、4EBP1總蛋白表達(dá)水平不受缺氧及shRaptor處理的影響，說(shuō)明敲減Raptor可切實(shí)有效地抑制mTORC1活性。
　　3.4 mTORC1失活抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性
　　活細(xì)胞工作站結(jié)果顯示，正常細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡集中，軌跡速度較小，缺氧處理可促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性。抑制mTORC1活性后，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)范圍明顯減小，軌跡速度降低，單個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力下降。劃痕實(shí)驗(yàn)也可得到相似

15、的結(jié)果。
　　3.5 缺氧處理抑制角質(zhì)形成細(xì)胞AMPK通路
　　缺氧3h、6h、12h后p-AMPK和p-ACC表達(dá)量顯著下降，AMPK、ACC總蛋白表達(dá)水平不受缺氧處理的影響。HaCaT細(xì)胞接受缺氧處理后亦出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。這些結(jié)果表明缺氧不影響AMPK的轉(zhuǎn)錄翻譯表達(dá)，可顯著抑制AMPK通路活性。
　　3.6 激活A(yù)MPK可抑制mTORC1活性
　　Met、AICAR處理可引起p-AMPK、p-ACC表達(dá)水平明顯

16、升高，AMPK通路激活，p-p70S6K和p-4EBP1表達(dá)量顯著下降，mTORC1被明顯抑制，說(shuō)明激活A(yù)MPK通路可抑制mTORC1。在HaCaT細(xì)胞中亦可得到一致結(jié)論。
　　3.7 激活A(yù)MPK可抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性
　　活細(xì)胞工作站結(jié)果顯示，缺氧處理可促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)范圍、軌跡速度增加。加入Met和AICAR后，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)范圍減小，軌跡集中，軌跡速度降低。在HaCaT細(xì)胞中亦可觀察到一致的現(xiàn)象，說(shuō)明激活A(yù)MPK會(huì)引

17、起單個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力下降。劃痕實(shí)驗(yàn)也可得到類似的結(jié)果。
　　結(jié)論：
　　總結(jié)本課題，可得到以下結(jié)論:
　　1.電場(chǎng)可引起角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)換，使細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫\(yùn)動(dòng)狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力;這一過(guò)程是通過(guò)電場(chǎng)抑制PTEN從而激活mTORC1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　2.電場(chǎng)可引起角質(zhì)形成細(xì)胞從正極向負(fù)極定向遷移，遷移速度增加，這一過(guò)程是通過(guò)自噬實(shí)現(xiàn)的。電場(chǎng)可引起自噬生成增加，細(xì)胞中溶酶體酸化正常，自噬

18、體和溶酶體順利融合，溶酶體可正常降解底物，自噬流通暢，不存在由于自噬流受損導(dǎo)致的自噬累積，下調(diào)細(xì)胞自噬水平不影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方向性，可顯著抑制細(xì)胞定向遷移速度。
　　3.缺氧可引起角質(zhì)形成細(xì)胞中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力顯著增加，這一效應(yīng)的原因是缺氧引起AMPK活性下降從而激活mTORC1通路。
　　4.本課題研究了創(chuàng)面微環(huán)境（電場(chǎng)、缺氧）對(duì)創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中角質(zhì)形成細(xì)胞啟動(dòng)和后續(xù)遷移的作用及分子機(jī)制，對(duì)揭示創(chuàng)面愈合規(guī)律有重要理論價(jià)值，也為臨床