維甲酸相關基因HA117抗神經元分化的初步研究.pdf

1、第一部分 HA117對人臍帶間充質干細胞(hUMSCS)向神經元樣細胞分化過程的影響
　　目的：HA117是ATRA小劑量、多次刺激HL-60細胞株后通過抑制消減雜交及基因芯片等技術得到的一個多藥耐藥基因。前期課題組通過實驗研究及生物信息學分析，推測HA117可能是一個抗分化相關基因。因此，本研究目的是觀察HA117對hUMSCS向神經元樣細胞分化過程的影響。
　　方法：獲取3代hUMSCS，流式檢測細胞表面特異性抗原，通過

2、成骨、成脂定向分化檢測hUMSCS多向分化能力。然后，轉導HA117過表達慢病毒建立HA117過表達hUMSCS，流式測定轉染率，神經元分化液培養(yǎng)誘導HA117過表達hUMSCS向神經元樣細胞方向分化，并設置空白對照組、陽性對照組及空載對照組，通過觀察各組分化時間，神經元樣細胞形態(tài)及 Western、q-PCR、免疫熒光技術檢測各組定向誘導分化后神經元標志物的表達水平來評價各組神經元樣細胞分化率。
　　結果：HA117過表達慢病毒

3、轉導hUMSCS的轉染率為68.9％，hUMSCS加入神經元誘導液誘導后，細胞體積變大，未發(fā)現(xiàn)明顯樹突及軸突，神經元標志物β-tubulin III、NSE和Nestin的 mRNA及蛋白在空白對照組中表達較少，甚至不表達，其表達水平在HA117組明顯低于陽性對照組及空載對照組，P<0.05，免疫熒光觀察到HA117組熒光明顯弱于陽性對照組及空載對照組，強于空白對照組。
　　結論：HA117在hUMSCS向神經元定向分化過程中起到

4、抗分化作用。
　　第二部分 HA117及SHH通路在先天性巨結腸中的表達及意義
　　目的：研究HA117及SHH信號通路（SHH、Ptch1、Gli1）在先天性巨結腸(Hirschsprung's disease，HSCR)中的表達情況，以探討其與HD發(fā)生發(fā)展中的關系。
　　方法：收集重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院2014-1015年經手術確診為HSCR患者的巨結腸組織標本30例，腸段分吻合段（正常對照組）、擴張段和痙攣段（

5、實驗組），運用實時熒光定量PCR(quantitative real—time PCR，qRT-PCR)、蛋白質印跡(Western blot)和免疫組織化學方法檢測HA117、SHH信號途徑在各段中的表達情況，對其進行定量和定性并比較。
　　結果：Q-PCR結果提示：痙攣段HA117 mRNA表達水平為1.52±0.17，明顯高于吻合段（0.28±0.04），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。痙攣段SHH、Ptch1、Gli1

6、 mRNA表達水平分別為0.53±0.11、0.48±0.11、0.62±0.13，明顯低于吻合段（1.23±0.26、1.20±0.22、1.71±0.46），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Western-Blot結果提示: SHH、Ptch1、Gli1蛋白相對表達水平與mRNA表達水平一致，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；免疫組織化學(DAB染色)結果提示:痙攣段SHH、Ptch1、Gli1染色明顯弱于吻合段。