川芎嗪、丹參酮ⅡA對(duì)PG干細(xì)胞樣細(xì)胞惡性生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、立題依據(jù)：
　　肺癌是國(guó)內(nèi)外死亡率和發(fā)病率最高的惡性腫瘤類疾病，盡管針對(duì)肺癌的診斷手段和治療方法不斷革新，其遠(yuǎn)期生存期仍令人擔(dān)憂，轉(zhuǎn)移、耐藥及療后復(fù)發(fā)是導(dǎo)致其預(yù)后差的主要因素。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)理論的提出為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制揭示了新的視角，為腫瘤的治療帶來了新的希望，CSCs被認(rèn)為是具有異質(zhì)性的腫瘤組織中的含量極少的細(xì)胞亞群，在腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥等諸多方面都體現(xiàn)出強(qiáng)于已分化腫瘤細(xì)

2、胞的惡性生物學(xué)特性，分選、鑒別并靶向殺傷CSCs是當(dāng)前腫瘤學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。通過患者的臨床癥狀、血液流變學(xué)異常、微循環(huán)障礙等表現(xiàn)，可以判斷血瘀證是包括肺癌患者在內(nèi)的惡性腫瘤患者證候群中的重要證素，血瘀證不僅是肺癌等患者常見的客觀征象，也對(duì)惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生協(xié)同促進(jìn)作用?；钛幨欠伟┡R床治療處方中的重要構(gòu)成部分，活血藥不僅有效地改善患病機(jī)體血行狀況、緩解臨床癥狀，還對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、周期、侵襲、轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生一定的影響。在前期研究中，我

3、們已經(jīng)證實(shí)了川芎、蘇木、雞血藤、水蛭等活血藥對(duì)lewis肺癌的轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用，其抑制作用機(jī)理可能與影響CD44V6、p-選擇素、CD29、E-Cad、HIF-1α等蛋白表達(dá)有關(guān)，同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)蘇木、雞血藤等活血藥可對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，其抑制作用與細(xì)胞周期阻滯及促進(jìn)凋亡有關(guān)。本研究即是在前期研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)在備受關(guān)注的CSCs理論，觀察前期研究所用活血藥川芎、丹參的有效成分川芎嗪和丹參酮ⅡA對(duì)肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的增

4、殖、凋亡、粘附、侵襲、耐藥及血管生成等惡性生物學(xué)行為的影響，以期從影響肺癌干細(xì)胞的角度探索活血藥的作用機(jī)理和可能的作用靶點(diǎn)，為完善肺癌的血瘀證理論及臨床合理應(yīng)用活血藥提供科學(xué)依據(jù)。
　　研究目的：
　　1、分選并鑒定高轉(zhuǎn)移性人肺巨細(xì)胞癌PG（分為高轉(zhuǎn)移亞系PG-BE1、低轉(zhuǎn)移亞系PG-LH7）中的干細(xì)胞樣細(xì)胞，并探索PG原代細(xì)胞及不同氧濃度下干細(xì)胞樣細(xì)胞在粘附、侵襲、耐藥、血管生成等方面的差異;
　　2、研究活血藥川芎

5、、丹參的有效成分川芎嗪及丹參酮ⅡA對(duì)PG干細(xì)胞樣細(xì)胞增殖、凋亡、粘附、侵襲、血管生成、耐藥等的影響。
　　研究方法：
　　1、采用無血清成球培養(yǎng)法分選PG-BE1、PG-LH7細(xì)胞系中的干細(xì)胞樣細(xì)胞亞群，并采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)、細(xì)胞周期檢測(cè)及干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志(CD133、SOX-2、OCT-4、Nanog)檢測(cè)等驗(yàn)證其干性;
　　2、采用MTT實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度梯度川芎嗪、丹參酮ⅡA在24h、48h、72h等

6、不同時(shí)間點(diǎn)上對(duì)PG-BE1、PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞增殖的影響;
　　3、采用人造基底膜粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同氧濃度下PG-BE1和PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞、PG-BE1和PG-LH7原代細(xì)胞、活血藥干預(yù)后PG-BE1和PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞的粘附能力，采用免疫熒光染色法檢測(cè)上述各組細(xì)胞CD29、CD44V6蛋白的表達(dá)，采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞CD29、CD44V6蛋白的表達(dá)量;
　　4、采用Transwell

7、小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同氧濃度下PG-BE1和PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞、PG-BE1和PG-LH7原代細(xì)胞、活血藥干預(yù)后PG-BE1和PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞的侵襲能力，采用免疫熒光染色法檢測(cè)上述各組細(xì)胞E-Cad、N-Cad、Vimentin、MMP-2等蛋白的表達(dá)，采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞E-Cad、N-Cad、Vimentin、MMP-2等蛋白的表達(dá)量;
　　5、采用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同氧濃度下PG-BE1和

8、PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞、PG-BE1和PG-LH7原代細(xì)胞、活血藥干預(yù)后PG-BE1和PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞的VEGF的表達(dá)，采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞HIF-1α蛋白的表達(dá)量，采用RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞VEGF、HIF-1α mRNA的表達(dá);
　　6、采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PG-BE1、PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞對(duì)常用化療藥順鉑、吉西他濱及紫杉醇的耐受能力，采用Western blot法檢測(cè)不同氧濃度下PG-

9、BE1和PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞、PG-BE1和PG-LH7原代細(xì)胞、活血藥干預(yù)后PG-BE1和PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞的耐藥相關(guān)蛋白ABCG2的表達(dá)，采用RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞ABCG2 mRNA的表達(dá)。
　　研究結(jié)果：
　　1、采用無血清成球培養(yǎng)法培養(yǎng)的PG-BE1及PG-LH7細(xì)胞在培養(yǎng)至第4天開始出現(xiàn)較規(guī)則的球體，培養(yǎng)至第6天球體表面顏色變暗、折光性降低;平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PG-BE1成球細(xì)胞與原代細(xì)胞的

10、克隆灶形成數(shù)目分別為(8.06±1.31)個(gè)、(3.94±1.06)個(gè)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。PG-LH7成球細(xì)胞與原代細(xì)胞的克隆灶形成數(shù)目分別為(6.06±1.35)個(gè)、(2.67±1.33)個(gè)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001);PG-BE1成球細(xì)胞與原代細(xì)胞CD133表達(dá)分別為(7.158±4.209)％、(0.838±0.649)％，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.028)。PG-LH7成球細(xì)胞與原代細(xì)胞CD

11、133表達(dá)分別為(3.785±2.968)％、(0.653±0.311)％，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.081);PG-BE1成球細(xì)胞與原代細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例分別為(84.04±5.27)％、(50.57±1.78)％，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。PG-LH7成球細(xì)胞與原代細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例分別為(54.06±2.51)％、(55.71±1.29)％，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.366); PG-BE1成球細(xì)

12、胞的早期凋亡率、中晚期凋亡率及總凋亡率均低于原代細(xì)胞，p值分別為:0.021、0.001、＜0.001。PG-LH7成球細(xì)胞的早期凋亡率、中晚期凋亡率及總凋亡率亦低于原代細(xì)胞，p值均為0.002; PG-BE1成球細(xì)胞表面干細(xì)胞表面標(biāo)志SOX-2、OCT-4及Nanog的表達(dá)強(qiáng)于其親代細(xì)胞，p值分別為0.017、0.01、0.029; PG-LH7成球細(xì)胞表面干細(xì)胞表面標(biāo)志SOX-2、OCT-4及Nanog的表達(dá)亦強(qiáng)于其親代細(xì)胞，p值分

13、別為0.001、0.032、0.044。
　　2、川芎嗪作用PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞24h、48h后，隨藥物濃度增加而抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)川芎嗪濃度達(dá)到300μ g/ml后，抑制作用增強(qiáng)不明顯。不同濃度的川芎嗪的抑制增殖作用均有時(shí)效關(guān)系;川芎嗪對(duì)PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞的抑制作用在不同時(shí)間上均存在量效關(guān)系。10μ g/ml、50μ g/ml濃度川芎嗪在48h時(shí)作用最強(qiáng)，100μ g/ml、300μ g/ml、500μ g/ml濃度組隨

14、時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用增強(qiáng);丹參酮ⅡA對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的增殖抑制作用存在量效關(guān)系。濃度為0.25μ g/ml、0.50μ g/ml的丹參酮ⅡA隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而有更強(qiáng)的抑制增殖能力;0.75μ g/ml、1.00μ g/ml、1.25μ g/ml的丹參酮ⅡA在作用時(shí)間為48h時(shí)抑制作用最強(qiáng);丹參酮ⅡA對(duì)PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞的增殖抑制作用存在量效和實(shí)效關(guān)系。
　　3、PG-BE1及PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞的粘附能力均強(qiáng)于其原

15、代細(xì)胞，其p值分別為0.013、0.005; PG-BE1及PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞在不同氧濃度環(huán)境下的粘附能力均無差異，其p值分別為0.74、0.151;不同濃度川芎嗪及丹參酮ⅡA均可抑制PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的粘附能力，且不同濃度川芎嗪的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，中、高濃度丹參酮ⅡA的抑制作用強(qiáng)于低濃度，中、高濃度之間抑制作用無差異(p=0.588);不同濃度川芎嗪及丹參酮ⅡA均可抑制PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞的粘附能力，不同濃度川芎

16、嗪的抑制作用無差異，中、低劑量丹參酮ⅡA的抑制作用弱于高劑量，中、低劑量之間抑制作用無差異(p=0.585)。PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的CD29及CD44V6表達(dá)均強(qiáng)于其原代細(xì)胞(p＜0.001); PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞在不同氧濃度下的CD29表達(dá)無差異(p=0.188)，PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞在常氧環(huán)境下CD44V6的表達(dá)量高于低氧環(huán)境(p＜0.001); PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞的CD44V6表達(dá)量高于原代細(xì)胞(p=0.028

17、)，CD29的表達(dá)與原代細(xì)胞無差異(p=0.302); PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞在常氧環(huán)境下CD29的表達(dá)量高于低氧環(huán)境(p=0.004)，而CD44V6在不同氧環(huán)境下表達(dá)無差異(p=0.071);不同濃度的川芎嗪及丹參酮ⅡA均可抑制PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞CD29的表達(dá)，川芎嗪及丹參酮ⅡA的抑制作用均無劑量依賴性;高濃度川芎嗪及不同濃度丹參酮Ⅱ A可抑制PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞CD44V6的表達(dá)，丹參酮ⅡA的抑制作用存在劑量依賴性;不

18、同劑量川芎嗪及丹參酮ⅡA對(duì)PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞CD29的表達(dá)均無抑制作用。但可抑制CD44V6的表達(dá)，不同濃度之間的抑制作用無劑量相關(guān)性。
　　4、PG-BE1及PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞的侵襲能力均強(qiáng)于其原代細(xì)胞(p＜0.001)，低氧環(huán)境中的PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞侵襲能力強(qiáng)于常氧環(huán)境(p=0.038)，PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞在不同氧環(huán)境下侵襲能力無差異(p=0.406);PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞E-Cad、N-Cad表達(dá)

19、強(qiáng)于原代細(xì)胞（其p值分別為0.003、＜0.001），PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞Vimentin的表達(dá)強(qiáng)于原代細(xì)胞（p值為0.032）;低氧環(huán)境下，PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的E-Cad表達(dá)下調(diào)(p＜0.001)，N-Cad、Vimentin、MMP-2的表達(dá)上調(diào)（p值均小于0.05）。PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞N-Cad、Vimentin、MMP-2的表達(dá)均上調(diào)（p值均小于0.05）;
　　不同濃度川芎嗪及丹參酮ⅡA均可抑制PG-BE

20、1干細(xì)胞樣細(xì)胞的侵襲能力（各組與空白組相比，p值均小于0.05），不同濃度川芎嗪的抑制作用有劑量依賴性，中、低濃度丹參酮ⅡA的抑制作用弱于高濃度，低、中濃度之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.349);不同濃度川芎嗪及丹參酮ⅡA均可抑制PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞的侵襲能力，川芎嗪及丹參酮ⅡA的抑制作用均無劑量依賴性。川芎嗪及丹參酮ⅡA對(duì)兩種干細(xì)胞樣細(xì)胞侵襲能力的影響與對(duì)E-Cad、N-Cad、Vimentin、MMP-2等蛋白的表達(dá)有關(guān)。<

21、br>　　5、PG-BE1、PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞VEGF表達(dá)均顯著強(qiáng)于原代細(xì)胞(p＜0.001)，低氧環(huán)境下PG-BE1、PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞VEGF表達(dá)均顯著強(qiáng)于常氧環(huán)境(p＜0.001)。不同濃度川芎嗪與丹參酮ⅡA均對(duì)PG-BE1、PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞的VEGF表達(dá)均有一定的抑制作用，且抑制作用有劑量相關(guān)性。
　　PG-BE1、PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞的HIF-1α的表達(dá)均強(qiáng)于其原代細(xì)胞(p＜0.05)，PG-BE

22、1干細(xì)胞樣細(xì)胞在低氧環(huán)境下的HIF-1α的表達(dá)強(qiáng)于常氧環(huán)境(p＜0.05)，PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞在低氧環(huán)境下的HIF-1α的表達(dá)與常氧環(huán)境表達(dá)無差異(p=1.0);不同濃度川芎嗪及丹參酮ⅡA均可對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用(p＜0.05)，不同濃度川芎嗪之間，抑制作用無差異(p＞0.05)，低、中濃度丹參酮ⅡA的抑制作用強(qiáng)于高濃度。不同濃度川芎嗪對(duì)PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)均無明顯抑制作用

23、。不同濃度丹參酮ⅡA均可對(duì)PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，高濃度丹參酮ⅡA的抑制強(qiáng)度強(qiáng)于低、中濃度組。川芎嗪及丹參酮ⅡA對(duì)兩種細(xì)胞VEGF、HIF-1α表的抑制與其下調(diào)其mRNA表達(dá)相關(guān)。
　　6、MTT結(jié)果顯示，PG-BE1、PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞對(duì)順鉑、吉西他濱、紫杉醇的耐受性普遍強(qiáng)于其原代細(xì)胞。PG-BE1、PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞的化療耐藥性可能與其高表達(dá)ABCG-2有關(guān)（與原代細(xì)胞相比，p＜0.

24、001），此外，兩種細(xì)胞在常氧環(huán)境中ABCG-2蛋白的表達(dá)量高于低氧環(huán)境(p＜0.001);川芎嗪與丹參酮ⅡA均可抑制ABCG-2蛋白表達(dá)，不同濃度抑制作用無劑量依賴性。除低劑量丹參酮ⅡA組外，各劑量川芎嗪及丹參酮ⅡA對(duì)PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞ABCG-2蛋白的表達(dá)均有一定的抑制作用，不同濃度抑制作用亦無劑量依賴性。川芎嗪及丹參酮ⅡA對(duì)兩種細(xì)胞ABCG-2表達(dá)的抑制與其下調(diào)其mRNA表達(dá)相關(guān)。
　　研究結(jié)論：
　　1、采用無

25、血清成球培養(yǎng)法可一定程度上分選肺癌細(xì)胞系中的CSCs亞群，可通過對(duì)其自我更新、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、表面標(biāo)志等的檢測(cè)驗(yàn)證其干性。
　　2、川芎嗪和丹參酮ⅡA均可抑制PG-BE1、PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞增殖，川芎嗪抑制作用較弱，兩者的抑制作用有一定的量效、時(shí)效關(guān)系。
　　3、PG-BE1、PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞有較其原代細(xì)胞更強(qiáng)的人造基底膜粘附能力，川芎嗪和丹參酮ⅡA可抑制其粘附作用，其抑制作用與影響CD29及CD44V6蛋

26、白的表達(dá)有關(guān)。
　　4、PG-BE1、PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞有較其原代細(xì)胞更強(qiáng)的侵襲能力，且其侵襲能力在低氧環(huán)境中更明顯，川芎嗪和丹參酮ⅡA可一定程度上抑制其侵襲能力，其抑制作用與影響E-Cad、N-Cad、Vimentin、MMP-2等蛋白的表達(dá)有關(guān)。
　　5、PG-BE1、PG-LH7干細(xì)胞樣細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的促血管生成能力，川芎嗪和丹參酮ⅡA可通過抑制其HIF-1α及VEGF的表達(dá)而抑制其血管生成能力。
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