小鼠OG-MEF細(xì)胞重編程過程中細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究和牛TWSIN-OG細(xì)胞誘導(dǎo)重編程的初步研究.pdf

1、本文從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一章 小鼠OG-MEF細(xì)胞重編程過程中細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究
　　誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞相比胚胎干細(xì)胞具有無可比擬的優(yōu)越性，已經(jīng)成為研究細(xì)胞增殖、分化和再生醫(yī)學(xué)的重要技術(shù)手段。前人的研究發(fā)現(xiàn)，iPSCs的產(chǎn)生過程中細(xì)胞將經(jīng)歷三種形態(tài)變化:成纖維細(xì)胞型(MEF)→上皮樣細(xì)胞→胚胎干細(xì)胞樣克隆(iPSCs)，了解重編程過程中三種不同形態(tài)細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)變化，對于闡明iPSCs的重編程機(jī)理以及提高其誘導(dǎo)效率具有重要

2、作用。為此，本研究建立了無飼養(yǎng)層條件下誘導(dǎo)iPSCs的技術(shù)方法，同時(shí)比較了兩種不同的培養(yǎng)液添加物（血清和血清替代物）對于iPSCs誘導(dǎo)效率的影響。進(jìn)而，利用Thy1、SSEA1兩種抗體染色和Oct4-GFP報(bào)告系統(tǒng)，對重編程過程中PD3、PD6、PD9、PD12細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，含血清替代物的培養(yǎng)液中iPSCs的誘導(dǎo)效率顯著高于血清培養(yǎng)液(15.2％ vs2.59％)，且含血清替代物培養(yǎng)液中誘導(dǎo)獲得的iPSCs在

3、細(xì)胞克隆形態(tài)，Oct4-GFP表達(dá)等方面明顯優(yōu)于血清培養(yǎng)液。進(jìn)而，本研究利用無飼養(yǎng)層及血清替代物培養(yǎng)液為誘導(dǎo)系統(tǒng)，對誘導(dǎo)過程中PD3、PD6、PD9、PD12天的細(xì)胞染色進(jìn)行流式分析，探討重編程過程不同階段細(xì)胞特性標(biāo)記的動(dòng)力學(xué)變化。結(jié)果顯示，在PD3時(shí)，Thy1+SSEA1-細(xì)胞占68.6％，Thy1-SSEA1-細(xì)胞占23.8％，Thy1-SSEA1+細(xì)胞占6.63％。PD6時(shí)，Thy1+SSEA1-細(xì)胞數(shù)量顯著降低至16.8％，而T

4、hy1-SSEA1-細(xì)胞達(dá)到55.1％，Thy1-SSEA1+細(xì)胞數(shù)量顯著提升至27.3％，所以在重編程的早期，細(xì)胞表面標(biāo)記的變化為Thy1+ SSEA1-細(xì)胞→Thy1-SSEA1-細(xì)胞→Thy1-SSEA1+細(xì)胞。PD9時(shí)， SSEA1-GFP+細(xì)胞所占比例為12.6％，SSEA1-GFP-所占的比例為18.2％，SSEA1+GFP+細(xì)胞所占的比例為51.7％，在PD12時(shí)，SSEA1-GFP+細(xì)胞所占的比例上升為23.8％，SSE

5、A1-GFP-細(xì)胞所占的比例下降到11.6％，而SSEA1+GFP+細(xì)胞所占的比例上升到57.5％。所以誘導(dǎo)的后期，重編程細(xì)胞由SSEA1+GFP-細(xì)胞→SSEA1+GFP+細(xì)胞。因此，整個(gè)重編程過程中細(xì)胞特性標(biāo)記的動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律為，Thy1+SSEA1-GFP-→Thy1-SSEA1-GFP-→Thy1-SSEA1+ GFP。→Thy1-SSEA1+GFP+。將流式分選的Thy1-SSEA1+GFP+細(xì)胞接種于飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)，形成的

6、iPSCs克隆形態(tài)均一，生長狀態(tài)良好，克隆邊緣整齊、有明顯的遮光，且都表達(dá)GFP綠色熒光，堿性磷酸酶染色都呈陽性。對其進(jìn)行免疫熒光染色分析顯示，多能性標(biāo)記蛋白Oct4、Sox2、Nanog、 E-cadherin、SSEA1均呈陽性染色。該iPSCs能夠體外分化形成類胚體，并表達(dá)三胚層標(biāo)記蛋白，Nestin（外胚層）、Brachyury（中胚層）和Gata4(內(nèi)胚層)。
　　第二章 牛TWSIN1-OG細(xì)胞誘導(dǎo)重編程的初步研究

7、r>　　體細(xì)胞導(dǎo)入特異性轉(zhuǎn)錄因子，可將已分化的細(xì)胞重編程為具有干細(xì)胞特性的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），iPS技術(shù)為牛、羊、豬等胚胎干細(xì)胞建系困難的大家畜動(dòng)物提供一種獲得多能干細(xì)胞的新途徑。雖然目前已獲得了具有部分多能性的牛iPSCs，但這些iPSCs都不能在體外進(jìn)行長期培養(yǎng)，并依賴外源轉(zhuǎn)錄因子的長期表達(dá)來維持克隆形狀，而內(nèi)源干細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并沒有被激活，當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)被沉默

8、后，iPSCs立即分化，且不同研究所獲得的iPSCs在細(xì)胞形態(tài)和多能性基因的表達(dá)等方面還存在明顯差異。將Oct4-GFP報(bào)告系統(tǒng)應(yīng)用于iPSCs重編程，為判斷重編程過程中內(nèi)源干性網(wǎng)絡(luò)的是否激活提供了有力的技術(shù)手段。本研究構(gòu)建了含有人Oct4-GFP報(bào)告基因的牛胎兒成纖維細(xì)胞（TWSIN1-OG），用以判斷牛iPSCs誘導(dǎo)重編程過程中內(nèi)源干性網(wǎng)絡(luò)的激活。通過將人源的OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC、NANOG、LIN28(OSKM

9、NL)導(dǎo)入TWSIN1-OG細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)牛iPSCs。當(dāng)使用不同體積的病毒感染細(xì)胞，通過DsRed紅色熒光蛋白指示感染效率，結(jié)果顯示，使用10μl、20μl、30μl、40μl病毒的感染效率分別為54.3％、62.2％、74.8％、79.3％。進(jìn)而確定使用40μl的OSKMNL病毒進(jìn)行牛iPSCs的誘導(dǎo)，觀察誘導(dǎo)過程中細(xì)胞的形態(tài)變化。結(jié)果顯示，與小鼠類似，在誘導(dǎo)第三天細(xì)胞開始由成纖維細(xì)胞型向上皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變，第六天上皮樣的細(xì)胞開始向上聚