FoxO1轉(zhuǎn)錄因子在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)及其與炎癥的關(guān)系.pdf

1、研究目的：
　　1.觀察FoxO1轉(zhuǎn)錄因子在巨噬細(xì)胞活化前后的表達(dá)情況。
　　2.觀察FoxO1轉(zhuǎn)錄因子敲低后對巨噬細(xì)胞炎癥過程的影響。
　　3.檢測FoxO1是否通過TGF-β來影響炎癥反應(yīng)。
　　研究方法：
　　1.應(yīng)用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）激活巨噬細(xì)胞，酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測LPS活化巨噬細(xì)

2、胞的最適濃度和時間。收集LPS各個濃度、培養(yǎng)時間的細(xì)胞上清液。ELISA試劑盒檢測各個濃度和時間段收集上清液中炎癥因子IL-6和TNF-α的含量，推出LPS活化巨噬細(xì)胞的最適時間及濃度。瓊脂糖凝膠電泳檢測Foxo1、Foxo3a、Foxo4、Foxo6四個基因在活化前后巨噬細(xì)胞的表達(dá)變化。實(shí)時熒光定量PCR檢測Foxo1基因的mRNA水平， Western blot檢測FOXO1蛋白表達(dá)。
　　2.敲低活化組巨噬細(xì)胞Foxo1基因

3、，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時熒光定量PCR和Western blot檢驗(yàn)小干擾RNA轉(zhuǎn)染效率。同時使用ELISA試劑盒檢驗(yàn)兩組細(xì)胞上清液IL-6、TNF-α的含量，比較活化組巨噬細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前后IL-6、TNF-α含量變化情況。
　　3.巨噬細(xì)胞敲低Foxo1表達(dá)，分兩組。一組不處理，另一組LPS激活細(xì)胞。應(yīng)用Western blot實(shí)驗(yàn)方法比較四組巨噬細(xì)胞中TGF-β蛋白的表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果：
　　1.脂多糖激活巨噬細(xì)

4、胞后，上清液中IL-6和TNF-α的含量逐漸升高。在LPS濃度50 ng/ml,培養(yǎng)36 h時測得炎癥因子含量均高于其他濃度和時間的LPS刺激下細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-6和TNF-α含量，表明此時是巨噬細(xì)胞活化的最適條件。采用實(shí)時熒光定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)得出活化組FoxO1轉(zhuǎn)錄因子在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)均低于未活化組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。
　　2.活化組敲低Foxo1，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、

5、實(shí)時熒光定量PCR、Western blot方法檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明FoxO1轉(zhuǎn)錄因子在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)量是轉(zhuǎn)染前的0.47倍，轉(zhuǎn)染成功。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：活化組巨噬細(xì)胞IL-6的含量為151.2 ng/ml±49.1 ng/ml，TNF-α含量為746.2 ng/ml±68.2 ng/ml，轉(zhuǎn)染組IL-6的含量上升到247.2 ng/ml±56 ng/ml、TNF-α的含量上升到1282 ng/ml±26.7 ng

6、/ml。轉(zhuǎn)染組炎癥因子IL-6和TNF-α含量明顯升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01）。
　　3.將正常巨噬細(xì)胞分為兩組：一組不處理，另一組敲低Foxo1。然后分別將兩組巨噬細(xì)胞再分為兩組：一組不做處理，另一組用LPS激活。采用Western blot分析四組細(xì)胞中TGF-β蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在活化組、活化組+siRNA組中TGF-β蛋白均有表達(dá)?；罨MTGF-β蛋白的相對表達(dá)量為0.37，活化組+siRNA組的相