IL-10對(duì)IL-1β刺激肺成纖維細(xì)胞表達(dá)ICAM-1作用的研究.pdf

1、目的：本研究利用體外培養(yǎng)大鼠胚肺成纖維細(xì)胞，采用RT-PCR、Western blot等檢測(cè)方法，測(cè)定肺成纖維細(xì)胞ICAM-1 mRNA表達(dá)水平及NF-κB P65蛋白表達(dá)，觀察IL-10對(duì)促炎因子(如IL-1β)刺激肺成纖維細(xì)胞表達(dá)粘附分子的影響，并探討NF-κB信號(hào)通路在其中的作用，為肺纖維化的治療提供新的理論依據(jù)。
　　方法：采用組織塊法對(duì)大鼠胚肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)：將Wister臨產(chǎn)孕鼠摘除眼球放血處死，立即75％酒精消毒皮

2、毛，在超凈工作臺(tái)上取出胎鼠，并對(duì)胎鼠開(kāi)胸取出肺組織，在平衡鹽溶液中剔除支氣管、結(jié)締組織等，然后將肺組織剪成1mm×1mm×1mm大小的小塊，加入含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，用無(wú)菌吸管吹打均勻，均勻涂于培養(yǎng)瓶中。在95％空氣、5％CO2、37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)4～6小時(shí)，待組織塊牢固貼壁后，適當(dāng)補(bǔ)充培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，一周左右待細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底后傳代，在傳代過(guò)程中去除小組織塊、紅細(xì)胞、上皮細(xì)胞等，使之成為形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)狀態(tài)一致的肺成纖

3、維細(xì)胞，即第5～6代肺成纖維細(xì)胞，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　每次實(shí)驗(yàn)均在指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞中進(jìn)行，以細(xì)胞數(shù)為1×105/ml，接種到預(yù)先放置6mm×22mm消毒蓋玻片的6孔板中。在培養(yǎng)箱中孵育至細(xì)胞近80％～100％融合時(shí)，棄去培養(yǎng)液，換不含胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，待細(xì)胞基本同步化于G0期時(shí)，將培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞分為三組(每組6復(fù)孔)，(1)對(duì)照組：?jiǎn)渭兗尤肱囵B(yǎng)液和二甲基亞砜(DMSO)培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞6小時(shí)；(2)IL-1β干預(yù)組：

4、加入IL-1β15ng/ml刺激肺成纖維細(xì)胞6小時(shí)；(3)IL-10+IL-1β干預(yù)組：加入IL-1010ng/ml和IL-1β15ng/ml共同刺激肺成纖維細(xì)胞6小時(shí)。采用RT-PCR法測(cè)定肺成纖維細(xì)胞中ICAM-1 mRNA表達(dá)水平，Western Blot蛋白免疫印跡法測(cè)定肺成纖維細(xì)胞中NF-κB P65蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1)成功培養(yǎng)Wistar臨產(chǎn)孕鼠原代肺成纖維細(xì)胞：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用組織切塊法培養(yǎng)Wi

5、star臨產(chǎn)孕鼠肺成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)5-10h后在倒置顯微鏡鏡下即觀察到圓形的細(xì)胞從組織塊周?chē)巫叱鰜?lái)，經(jīng)1周左右，這種圓形細(xì)胞逐漸變成橢圓、菱形，并成放射狀，足變長(zhǎng)，相鄰細(xì)胞融合，互相連接，細(xì)胞核大而圓，明亮。經(jīng)2～3次胰酶消化純化后，遺留的組織塊、紅細(xì)胞、上皮細(xì)胞等逐漸被清除，剩下形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)狀態(tài)一致的肺成纖維細(xì)胞(細(xì)胞形態(tài)一致，胞體豐滿(mǎn)，胞質(zhì)均勻，核仁清晰，可見(jiàn)核分裂相，生長(zhǎng)狀況良好)，為理想的肺成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　

6、2)RT-PCR方法測(cè)定肺成纖維細(xì)胞ICAM-1mRNA表達(dá)水平的變化：
　　ICAM-1mRNA在肺成纖維細(xì)胞中有一定量的基礎(chǔ)表達(dá)，對(duì)照組為0。350±0.032；IL-1β干預(yù)組ICAM-1mRNA的表達(dá)量為0.860±0.017，明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)；IL-10+IL-1β干預(yù)組ICAM-1mRNA的表達(dá)量為0。626±0.011，明顯低于IL-1β干預(yù)組，明顯高于對(duì)照組，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

7、　　3)Western blot方法測(cè)定肺成纖維細(xì)胞NF-κBP65蛋白表達(dá)水平的變化：
　　NF-κBP65蛋白在肺成纖維細(xì)胞中存在基礎(chǔ)表達(dá)，對(duì)照組為0.608±0.028；IL-1β干預(yù)組NF-κB P65蛋白表達(dá)為1.214±0.019，明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)；IL-10+IL-1β干預(yù)組NF-κB P65蛋白表達(dá)為0.730±0.011，明顯低于IL-1β干預(yù)組，明顯高于對(duì)照組，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。<