糖基化終末產(chǎn)物及Probucol對(duì)大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS脫偶聯(lián)和內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、凋亡及管腔形成作用的研究.pdf

1、前言：大量證據(jù)表明，體內(nèi)糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycaton end products，AGEs)的不斷累積與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。AGEs與AGE受體(receptor forAGE，RAGE)相互作用可誘導(dǎo)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，從而引發(fā)氧化應(yīng)激。
　　 有證據(jù)表明，AGEs誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是糖尿病性心肌病重要的促發(fā)因素。而現(xiàn)在的研究認(rèn)為，糖尿病性心肌病實(shí)

2、質(zhì)是一種微血管病變，更為重要的發(fā)病機(jī)制是微血管舒張功能障礙而引發(fā)的組織缺血。NO是保持血管組織舒張功能的重要因子，在糖尿病狀態(tài)下，血管組織中eNOS脫偶聯(lián)是導(dǎo)致NO生成減少的主要機(jī)制，致使血管組織舒張功能受損、組織缺血而引發(fā)一系列疾病。
　　 現(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為，組織中氧化應(yīng)激的爆發(fā)是eNOS脫偶聯(lián)發(fā)生的最主要原因。關(guān)于其具體機(jī)制，有研究者認(rèn)為依賴PKC的NADPH氧化酶激活在介導(dǎo)糖尿病患者內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激發(fā)生和并發(fā)癥形成中起重要作

3、用。Warboys CM最新研究發(fā)現(xiàn)，AGEs可以通過RAGE激活PKC，從而使腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的NADPH氧化酶表達(dá)增加。而NADPH氧化酶使細(xì)胞內(nèi)ROS增加，ROS又能導(dǎo)致eNOS脫偶聯(lián)的發(fā)生，進(jìn)而引起內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂。
　　 然而，糖尿病性心肌病作為一種心臟微血管病變，AGEs是否引起心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的ROS產(chǎn)生增加從而引起eNOS脫偶聯(lián)及其分子機(jī)制仍然不清晰。以往的實(shí)驗(yàn)研究采用大血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂來(lái)闡述糖尿病心

4、肌病的發(fā)病機(jī)制，這種準(zhǔn)確性尚存在質(zhì)疑。因此，本實(shí)驗(yàn)將心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞作為研究主體，觀察AGEs作用下心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)是否出現(xiàn)eNOS脫偶聯(lián)現(xiàn)象以及PKC/NADPH氧化應(yīng)激途徑在其中的作用。
　　 另外，現(xiàn)在的研究認(rèn)為，普羅布考(probucol)很可能通過對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制，顯著提高內(nèi)皮依賴性的血管舒張功能，改善內(nèi)皮功能障礙，因此在治療糖尿病微血管并發(fā)癥領(lǐng)域有廣闊的前景。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)觀察普羅布考能否通過抑制eNOS脫偶

5、聯(lián)的機(jī)制達(dá)到緩解內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、預(yù)防糖尿病性心肌病的作用。
　　 大量的證據(jù)表明，EPCs構(gòu)成重要的內(nèi)生系統(tǒng)以保持血管內(nèi)皮的完整性和血管內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，同時(shí)EPCs數(shù)量的減少也可以預(yù)測(cè)心血管疾病的發(fā)生。體外實(shí)驗(yàn)和臨床研究顯示，氧化應(yīng)激也會(huì)影響EPCs動(dòng)員，從而破壞血管內(nèi)皮的完整和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。對(duì)氧化應(yīng)激導(dǎo)致EPCs數(shù)量和功能異常的機(jī)制的了解，將會(huì)為理解心血管疾病的發(fā)病機(jī)制提供獨(dú)特的視角，并為臨床治療提供新的靶點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)要將

6、EPCs作為研究主體，觀察AGEs對(duì)其增殖、凋亡和管腔形成能力的影響，另外觀察普羅布考是否具有保護(hù)EPCs的作用。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 一、大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定20-30g Wistar胎大鼠取心臟組織，剪碎，0.1％Ⅱ型膠原酶和0.05％胰蛋白酶消化培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)。采用第3-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。內(nèi)皮細(xì)胞鑒定：熒光顯微鏡下觀察抗Ⅷ因子抗體結(jié)合情況。
　　 二、EPCs原代培養(yǎng)及鑒定采用Fic

7、oll密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁篩選法從大鼠骨髓分離EPCs；收集培養(yǎng)5d的EPCs，用激光共聚焦顯微鏡觀察，AC133和vWF雙染陽(yáng)性細(xì)胞為正在分化的EPCs。
　　 三、AGEs的制備20g/L，BSA與500mmol/L，葡萄糖溶于PH7.4 PBS中混勻，并加入終濃度為0.5mmol/L的EDTA，室溫放置過夜。0.2μm濾器過濾，滅菌封口后放置37℃避光孵育90d取出，熒光光譜掃描檢測(cè)制備的BSA-AGEs。實(shí)驗(yàn)前用P

8、H7.4 PBS透析去除未結(jié)合的葡萄糖及EDTA。
　　 四、實(shí)驗(yàn)分組
　　 對(duì)照組、AGEs(50mg/L，100mg/L，200mg/L)分別作用(0h，6h，12h，24h)組、AGEs100mg/L+LY33531(2.5μM，5μM，10μM)組、AGEs100mg/L+DPI(2.5μM，5μM，10μM)組和AGEs100mg/L+probucol(5μM，10μM，20μM)組。對(duì)照組加無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。

9、
　　 五、ROS測(cè)定采用2’，7’二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)熒光染色檢測(cè)ROS。DCFH-DA本身沒有熒光，但可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，細(xì)胞內(nèi)的ROS可以氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的DCF。用無(wú)血清的培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩次，再加入DCFH-DA(1:1000稀釋)，37℃孵育箱中孵育20mins后胰酶消化，1ml無(wú)血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度。
　　 六、NO、O2-測(cè)定

10、24孔板培養(yǎng)細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基孵育24h后，按照實(shí)驗(yàn)分組加入無(wú)血清培養(yǎng)基配置的刺激因素(LY33531、DPI和probucol)30mins后，各孔加AGEs100mg/L繼續(xù)孵育24h，收集上清液備用測(cè)定NO和O2-。具體步驟按照試劑盒說明書操作，721分光光度計(jì)測(cè)定各組吸光度。
　　 七、HPLC法測(cè)定BH4分別對(duì)酸性條件下氧化和堿性條件下氧化的標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定。酸性條件下氧化的標(biāo)本檢測(cè)出總生物喋呤包括BH4、BH2(二氫生物

11、喋呤)和B(氧化型生物喋呤)；在堿性條件下氧化的標(biāo)本可以檢測(cè)BH2和B。將BH2和B從總生物喋呤中除去即BH4含量。
　　 八、免疫組化法測(cè)定eNOS及RAGE的表達(dá)在放有玻片的24孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基孵育24h后，各組加入刺激因素24h，取出玻片，4％多聚甲醛固定30mins后，5％BSA封閉30mins加入一抗，室溫30mins后加入二抗，DAB染色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明后樹膠封片。
　　 九

12、、Western blot測(cè)定p47phox表達(dá)刮下25cm2培養(yǎng)瓶中細(xì)胞，5000rpm離心收集細(xì)胞，-70℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲?％濃縮膠及8％分離膠，豎板電泳儀上電泳90mins，PVDF轉(zhuǎn)膜45mins，5％脫脂奶粉封閉2h，1:500比例稀釋一抗，4℃過夜，二抗(1:2000)室溫孵育2h，DAB染色。
　　 十、MTT檢測(cè)EPCs增殖消化收集貼壁EPCs；以5×103/孔的細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，每孔體積200μl；放入3

13、7℃、5％CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)2h；待細(xì)胞基本融合，加入無(wú)血清DMEM作用12h；加入刺激因素；檢測(cè)時(shí)，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)孵育4h，吸除孔內(nèi)液體，每孔加入150μlDMSO，微量振蕩器震蕩10min，置酶標(biāo)儀測(cè)定OD490值。
　　 十一、EPCs管腔形成的檢測(cè)以5×105/孔的細(xì)胞數(shù)接種于涂有Matrigel的24孔板內(nèi)培養(yǎng)24h；加入不同濃度AGEs(50mg/L，100mg/L，200mg/L)分別作

14、用不同時(shí)間點(diǎn)(6h，12h，24h)；在100倍倒置相差顯微鏡下隨機(jī)選取3處管腔密集的視野計(jì)數(shù)管腔數(shù)。
　　 十二、AnnexinAv-PI流式細(xì)胞分析法檢測(cè)EPCs凋亡0.25％胰蛋白酶消化收集貼壁EPCs，用含2％BSA的PBS終止反應(yīng)，1000rpm離心5mins，棄上清，重復(fù)兩次，棄上清，加入500μl banding buffer，靜置，混勻后加入5μlAV，靜置，再加入5μl PI。同時(shí)準(zhǔn)備無(wú)AV/PI、只加AV、只

15、加PI三管做空白對(duì)照，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞鑒定原代細(xì)胞培養(yǎng)7d后，呈單層鋪路石樣生長(zhǎng)。采用Ⅷ因子鑒定，細(xì)胞漿及細(xì)胞膜均著紅色熒光，證明培養(yǎng)的細(xì)胞為心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 二、AGEs對(duì)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)eNOS脫偶聯(lián)的影響
　　 (一)AGEs引發(fā)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO、O2-生成變化不同濃度AGEs(50mg/L，100mg/L，200mg/L)分

16、別作用心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間(6h，12h，24h)，NO、O2-生成與AGEs存在量效和時(shí)效關(guān)系(P<0.01)；
　　 (二)AGEs引發(fā)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)、BH4含量的變化不同濃度AGEs(50mg/L，100mg/L，200mg/L)分別作用心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間(6h，12h，24h)，eNOS表達(dá)和BH4含量與AGEs存在量效和時(shí)效關(guān)系(P<0.05)。
　　 三、PKC/NADPH氧

17、化應(yīng)激途徑對(duì)eNOS脫偶聯(lián)的影響
　　 (一)AGEs引發(fā)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成的變化及PKC/NADPH氧化酶對(duì)其的影響不同濃度AGEs(50mg/L，100mg/L，200mg/L)分別作用心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間(6h，12h，24h)，ROS表達(dá)與AGEs存在量效和時(shí)效關(guān)系(P<0.05)；應(yīng)用DPI(5μM，10μM，20μM)后，ROS逐漸降低(P<0.05)；應(yīng)用LY33531(5μM，10μM，20μM

18、)濃度的增加，ROS表達(dá)均減少(P<0.05)。
　　 (二)PKC/NAPH氧化應(yīng)激途徑對(duì)AGEs誘導(dǎo)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO、O2-生成變化的影響心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞用PKC特異性抑制劑-LY33531(5μM，10μM，20μM)作用30mins后，加入AGEs(100mg/L)再孵育24h，無(wú)血清培養(yǎng)基處理組做空白對(duì)照。隨著LY33531濃度的增加，NO生成逐漸增家(P<0.05)，而O2-生成逐漸減少(P<0.05)。用N

19、ADPH氧化酶抑制劑-DPI(5μM，10μM，20μM)分別作用心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞30mins后，加入AGEs(100mg/L)再孵育24h，觀察各組NO、O2-生成的變化。隨著DPI濃度的增加，NO生成增加(P<0.05)，而O2-生成減少(P<0.01)。
　　 (三)PKC/NADPH氧化應(yīng)激途徑對(duì)AGEs誘導(dǎo)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)、BH4含量變化的影響應(yīng)用DPI(5μM，10μM，20μM)后，eNOS表達(dá)逐

20、漸減少(P<0.05)，BH4隨著DPI濃度增加而增加(P<0.05)隨著LY33531(5μM，10μM，20μM)濃度的增加，eNOS表達(dá)逐漸減少(P<0.05)，而BH4含量逐漸增加(P<0.05)。
　　 (四)PKC對(duì)AGEs誘導(dǎo)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞p47phox表達(dá)的影響p47phox表達(dá)在AGEs組較空白組明顯增加(P<0.01)，ROS表達(dá)增加(P<0.01)；隨著LY33531(5μM，10μM，20μM)濃度的

21、增加，p47phox表達(dá)減少(P<0.05)。
　　 五、probucol對(duì)AGEs誘導(dǎo)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS脫偶聯(lián)及PKC/NADPH氧化應(yīng)激途徑的影響
　　 (一)probucol對(duì)AGEs誘導(dǎo)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO、O2-生成變化的影響用probucol(5μM，10μM，20μM)分別作用細(xì)胞30mins后，加入AGEs(100mg/L)再孵育24h，無(wú)血清培養(yǎng)基處理組做空白對(duì)照。隨著probucol濃度的增

22、加，NO生成增加(P<0.05)，而O2-生成減少(P<0.05)。
　　 (二)probucol對(duì)AGEs誘導(dǎo)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞BH4、eNOS表達(dá)的影響probucol增加細(xì)胞內(nèi)BH4含量及eNOS表達(dá)(P<0.05)。
　　 (三)probucol對(duì)AGEs誘導(dǎo)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS和p47phox的表達(dá)的影響Probucol能夠明顯降低細(xì)胞內(nèi)ROS與p47phox蛋白的表達(dá)(P<0.05)。
　　 (四

23、)probucol對(duì)AGEs誘導(dǎo)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞RAGE的表達(dá)的影響Probucol能夠明顯降低細(xì)胞RAGE的表達(dá)(P<0.05)。
　　 六、EPCs的鑒定原代培養(yǎng)24h后，細(xì)胞大部分呈小圓形；差速貼壁篩選后，培養(yǎng)一天可見少量細(xì)胞貼壁；3d后細(xì)胞開始伸展成梭形或紡錘形。AC133、vWF雙陽(yáng)性熒光染色為正在分化的EPCs。
　　 七、AGEs對(duì)EPCs增殖、凋亡及管腔形成的影響AGEs影響EPCs的增殖能力，具有劑量

24、和時(shí)間依賴性。同一時(shí)間，隨濃度增加其影響作用更強(qiáng)(P<0.01)。相同濃度，在6-24h期間，隨時(shí)間延長(zhǎng)，AGEs減緩EPCs增殖的速度(P<0.01)；AnnexinV/PI流式細(xì)胞分析法檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著AGEs濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，EPCs總凋亡率亦顯著增加(P<0.01)；體外管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AGEs顯著降低EPCs體外管腔形成能力，200mg/L最為顯著(P<0.01)。
　　 八、probucol對(duì)EPC

25、s增殖、凋亡和管腔形成的影響不同濃度probucol(5μ M，10μ M，20μ M)孵育30mim后，100mg/LAGEs繼續(xù)作用24h，觀察EPCs的增殖、凋亡和管腔形成能力。結(jié)果顯示probucol恢復(fù)AGEs對(duì)EPCs增殖能力降低的影響，降低細(xì)胞凋亡數(shù)，增加管腔形成數(shù)目，均有顯著性的差異(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、AGEs能夠引發(fā)大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS脫偶聯(lián)。
　　 2、AGE

26、s可能通過PKC/NADPH氧化應(yīng)激途徑引發(fā)大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS脫偶聯(lián)。
　　 3、Probucol可能通過抑制PKC/NADPH氧化應(yīng)激途徑，從而阻斷eNOS脫偶聯(lián)的發(fā)生，達(dá)到抑制AGEs引發(fā)氧化應(yīng)激的目的。
　　 4、AGEs可能通過促進(jìn)EPCs凋亡，抑制其增殖及管腔形成能力，從而影響糖尿病時(shí)EPCs修復(fù)受損血管的能力。
　　 5、Probucol可以抑制AGEs引發(fā)的EPCs凋亡，恢復(fù)其增殖及管腔