家蠶質(zhì)多角體病毒RDRP的基因克隆、表達(dá)及定位研究.pdf

1、RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RDRP)是RNA病毒增殖復(fù)制的重要酶類,具有轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶的雙重活性,即一方面參與mRNA的轉(zhuǎn)錄,指導(dǎo)合成病毒增殖復(fù)制所需要的蛋白質(zhì)和酶類;另一方面參與以病毒RNA為模版的子代病毒基因的復(fù)制.家蠶質(zhì)多角體病毒(Bombyx mori Cytoplasmic Polyhedrosis Virus,BmCPV)是呼腸孤病毒科,質(zhì)多角體病毒屬的代表種,為雙鏈

2、RNA病毒.已有的BmCPV冷凍電鏡三維重構(gòu)的研究結(jié)果表明,在病毒衣殼五重軸的內(nèi)表面各有一花形結(jié)構(gòu),位于B-突起(B-spike)的近內(nèi)側(cè),推測(cè)為轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物(TEC),可能是BmCPV結(jié)構(gòu)蛋白VP2的對(duì)應(yīng)成分.應(yīng)用RT-PCR和分子克隆等技術(shù)成功地從BmCPV中國(guó)株的dsRNA中分三段克隆了RDRP基因,大小分別為1442bp,827bp,1675bp,進(jìn)行基因全序列的拼接后,獲得了全長(zhǎng)完整的BmCPV(C)RDRP基因(GenBan

3、k序列號(hào)為:AY496445),該基因全長(zhǎng)3691bp,GC含量為41.99﹪,讀碼框?yàn)?-3678bp,共編碼1225個(gè)氨基酸(GenBank序列號(hào)為:AAR88092).應(yīng)用Vector NT和DNAtools等軟件對(duì)其氨基酸序列一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析.對(duì)BmCPV-RDRP基因序列和pET-28b載體的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行分析,設(shè)計(jì)合成三對(duì)表達(dá)引物,應(yīng)用RT-PCR等技術(shù)利用pET-28b載體,成功構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pET28b-RD

4、RP,并用IPTG(1mmol/L)誘導(dǎo)的方法,在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)了帶有6×His的融合蛋白,蛋白質(zhì)分子量為138kDa.應(yīng)用分子生物學(xué)方法和免疫電鏡技術(shù),通過(guò)對(duì)BmCPV(C)RDRP的基因克隆、表達(dá)及定位研究,使對(duì)BmCPV冷凍電鏡三維重構(gòu)方面的研究成果與分子生物學(xué)方面的研究結(jié)果有機(jī)地結(jié)合,從而為尋找RDRP的活性中心,研究病毒在體內(nèi)的復(fù)制機(jī)制、酶的功能和活性等方面提供理論基礎(chǔ),也可以根據(jù)RDRP的活性中心結(jié)構(gòu)開展短