Rab25在非小細(xì)胞肺癌厄洛替尼獲得性耐藥中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、近年來(lái)肺癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈持續(xù)上升趨勢(shì)，而這一趨勢(shì)在中國(guó)尤其明顯。據(jù)報(bào)道，肺癌在我國(guó)已經(jīng)成為發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，對(duì)人群健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。而在肺癌病例中，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占據(jù)了絕大部分。不幸的是，將近80％的NSCLC病人被診斷時(shí)已經(jīng)處于晚期。他們不像早期病人能通過(guò)手術(shù)等治療獲得較高的生存率，臨床上對(duì)這些病人的治療手段也是很有限的。厄洛替尼（erloti

2、nib）作為表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸酶抑制劑(Tyrosine Kinase Inhibitor, TKI)給晚期NSCLC病人，特別是對(duì)EGFR敏感突變的病人帶來(lái)了巨大的希望。但是，幾乎所有的病人在用藥半年到一年時(shí)會(huì)產(chǎn)生厄洛替尼耐藥。盡管現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種因素參與了耐藥的發(fā)生，但仍有30％左右的病人耐藥的原因尚不清楚。因此，對(duì)NSCLC發(fā)生EGFR-TKI獲得性耐藥

3、機(jī)制的進(jìn)一步探索是當(dāng)前本領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。
　　Rab25是一種分布在上皮細(xì)胞的小GTP酶，其異常表達(dá)與包括肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道利用基因芯片的方法研究發(fā)現(xiàn)Rab25可能與厄洛替尼等3種TKI耐藥都相關(guān)，但其在NSCLC厄洛替尼獲得性耐藥中的作用和機(jī)制有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。
　　經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與調(diào)控多種腫瘤的增殖分化及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。研究表明，在肺腺癌NCI-H1650細(xì)胞中，

4、EGFR的突變特別是T790M突變能磷酸化并激活β-catenin，從而介導(dǎo)核內(nèi)反式激活，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的敏感性下降。而敲低β-catenin的表達(dá)能夠明顯改善非敏感的肺腺癌H1975細(xì)胞對(duì)不可逆性TKI(BIBW2992)的敏感性。這些證據(jù)都表明，β-catenin在TKI原發(fā)和繼發(fā)性耐藥中可能發(fā)揮了一定的作用。而β-catenin在PC9/ER細(xì)胞中是否也是Rab25介導(dǎo)的厄洛替尼敏感性的下游機(jī)制引起了我們的研究興趣。

5、>　　目的：
　　研究Rab25在厄洛替尼耐藥細(xì)胞(PC9/ER)與親本細(xì)胞中的表達(dá)差異;通過(guò)基因敲低手段明確其在NSCLC發(fā)生厄洛替尼獲得性耐藥中的作用，以期為豐富對(duì)厄洛替尼耐藥的認(rèn)識(shí)提供新思路、新理念。
　　方法：
　　1.在課題組前期誘導(dǎo)獲得的耐藥細(xì)胞PC9/ER基礎(chǔ)上，傳代培養(yǎng)并比較其與親本細(xì)胞PC9在形態(tài)上的差異;利用CCK-8法鑒定PC9/ER細(xì)胞的耐藥性，并計(jì)算耐藥指數(shù)。
　　2.利用qPCR和We

6、stern-Blot比較Rab25在PC9/ER及PC9細(xì)胞間基因和蛋白表達(dá)水平的差異;利用梯度厄洛替尼濃度刺激兩株細(xì)胞，比較兩者Rab25蛋白水平變化及劑量依賴效應(yīng);利用免疫熒光法定位Rab25蛋白在兩者細(xì)胞定位的不同。
　　3.利用siRNA和慢病毒(LV)轉(zhuǎn)染技術(shù)，敲低Rab25在PC9/ER細(xì)胞中的表達(dá)，研究Rab25敲減對(duì)改善厄洛替尼耐藥的作用;運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)敲減組與對(duì)照組的細(xì)胞周期變化，明確Rab25敲低對(duì)細(xì)胞增殖

7、特性的作用。
　　4.在PC9/ER細(xì)胞敲低Rab25表達(dá)的基礎(chǔ)上，用Western-Blot探索Wnt信號(hào)通路蛋白的改變狀態(tài)，并運(yùn)用激動(dòng)劑LiCl對(duì)信號(hào)通路恢復(fù)活性以檢測(cè)PC9/ER細(xì)胞對(duì)厄洛替尼敏感性的變化。
　　結(jié)果：
　　1.傳代培養(yǎng)的PC9/ER及PC9細(xì)胞，在低倍鏡下觀察到:PC9細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，而PC9/ER細(xì)胞呈類圓形;高倍鏡下觀察到:PC9細(xì)胞呈散在分布，PC9/ER細(xì)胞呈連續(xù)片狀分布。CCK-8實(shí)驗(yàn)表

8、明，PC9/ER細(xì)胞的IC50值遠(yuǎn)高于PC9細(xì)胞[（7.85±1.53）μMvs(0.12±0.04)μM，P＜0.01）]，PC9/ER細(xì)胞的耐藥指數(shù)為68.21±21.42，提示耐藥細(xì)胞PC9/ER可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.同等厄洛替尼濃度刺激條件下，Rab25的基因和蛋白表達(dá)在PC9/ER細(xì)胞均高于PC9細(xì)胞(P＜0.05);增高的Rab25蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜;在PC9及PC9/ER細(xì)胞中，Rab25的蛋白水平在0-1μM

9、厄洛替尼之間隨刺激濃度的遞增而增高。
　　3.成功篩選siRab25序列并轉(zhuǎn)染PC9/ER細(xì)胞并敲低Rab25的表達(dá)，敲低組的IC50明顯低于對(duì)照組[（0.59±0.33）vs（6.14±0.92）μM，P＜0.05];敲低組的增殖指數(shù)明顯低于對(duì)照組[(0.53±0.10)vs(0.89±0.06)，P＜0.05]。
　　4.厄洛替尼作用于PC9/ER細(xì)胞后，β-catenin蛋白水平明顯高于PC9細(xì)胞(P＜0.05);免疫

10、熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)β-catenin主要表達(dá)于細(xì)胞核;β-catenin和p-GSK-3β蛋白水平在LV-Rab25組低于LV-control組;而LiCl(10mM)能在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中升高LV-Rab25組細(xì)胞的β-catenin表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.Rab25在PC9/ER細(xì)胞中高表達(dá)，對(duì)其厄洛替尼耐藥具有促進(jìn)作用。
　　2.Wnt信號(hào)通路的激活，導(dǎo)致β-catenin的核表達(dá)增加，在Rab25介導(dǎo)的PC9細(xì)胞厄