虎杖苷對燒傷后創(chuàng)面愈合的治療作用及機理.pdf

1、背景：藥用的虎杖(polygonum cuspidatum sieb.etzucc)為蓼科蓼屬多年生草本植物虎杖的干燥根莖和根(葉也入藥)，主要含有蒽醌類化合物白藜蘆醇苷、水溶性多糖和鞣質等成分，性味微寒微苦，歸肝、膽、肺經(jīng)，有祛風利濕、散瘀定痛、止咳化痰之功效。中醫(yī)臨床用于治療濕熱黃疸、肺熱咳嗽、瘡癰腫毒、關節(jié)痹痛、經(jīng)閉經(jīng)痛、水火燙傷、跌打損傷等?；⒄榷嗄陙硪恢笔菬齻?、創(chuàng)傷創(chuàng)面愈合治療方劑中的一味主藥?；⒄溶?polydatin，PD

2、)是虎杖的有效活性成分，是從中所提取出的5種結晶中的第4種，又名虎杖4號或白藜蘆醇甙。其化學名為3，4’，5-三羥基芪-3-β-D-單葡萄糖苷(3，4，5-trihydroxystilbene-3-β-mono-D-glucoside)。眾多實驗研究顯示虎杖苷具有多個靶點的藥理作用，如：抗氧化作用；減少細胞因子、炎性介質分泌；改善微循環(huán)血流及凝血狀態(tài)；減少白細胞與內皮細胞的粘附等。
　　 燒傷后創(chuàng)面愈合過程是長時間大量細胞相互作

3、用的結果。早期炎性細胞自循環(huán)進入局部損傷部位，單核細胞活化為巨噬細胞，在創(chuàng)面愈合中扮演重要角色，包括水解酶釋放、吞噬作用以及分泌各種細胞因子和生長因子，反過來調控各種細胞的相互作用。隨后，這些生長因子觸發(fā)活化成纖維細胞和角質形成細胞，炎癥階段隨后進入合成階段。在這個階段，血管完整性得以重建，軟組織缺損被成纖維細胞產生的新結締組織填平，新生上皮覆蓋創(chuàng)面。這些過程是相互依賴的，膠原合成與新生血管形成同時發(fā)生，從而形成由毛細血管、成纖維細胞、

4、炎性細胞、基質蛋白共同組成的肉芽組織。由于活化的巨噬細胞、中性粒細胞、血小板產生的細胞因子和生長因子的作用，成纖維細胞由周圍組織遷移入創(chuàng)面，產生由膠原蛋白、葡胺聚糖、蛋白聚糖及彈力蛋白共同組成的基質，膠原蛋白逐漸成為主要基質蛋白。愈合的最后階段時是上皮化，包括表皮細胞從創(chuàng)面邊緣到創(chuàng)面的遷移、增殖和分化。
　　 虎杖苷經(jīng)過本室30余年研究，作為靜脈注射劑已取得國家Ⅰ類新藥臨床試驗批件(國家食品藥品管理局批件號2006L00301)

5、，現(xiàn)已進入Ⅱ期臨床試驗，但虎杖苷是否適合皮膚燒傷創(chuàng)面治療，是否有利于燒傷創(chuàng)面修復，尚未見報告。燒傷后創(chuàng)面缺血再灌注損傷、血管通透性改變、炎細胞浸潤、炎性介質及生長因子分泌等病理改變，而虎杖苷的抗炎、抗自由基、改善微循環(huán)的效應為虎杖苷應用于燒傷創(chuàng)面治療提供了理論基礎，使其有望成為大面積燒傷治療的有效的臨床藥物。因此本課題集中探討虎杖苷對燒傷創(chuàng)面愈合的療效和機理。
　　 目的：(1)研究不同濃度虎杖苷成纖維細胞生物學特性的影響；(2

6、)研究不同濃度虎杖苷對角質形成細胞生物學特性的影響；(3)研究虎杖苷對大鼠燒傷創(chuàng)面的治療作用及機理。
　　 前兩項研究查明虎杖苷對燒傷創(chuàng)面修復的兩個主要細胞(成纖維細胞和角質形成細胞)生長和合成功能影響，確定促進細胞增殖和引起細胞凋亡的虎杖苷濃度，從而為配制治療燒傷的虎杖苷凝膠打下基礎，也為虎杖苷凝膠的治療機制提供細胞學依據(jù)。
　　 后一項研究查明三個濃度的虎杖苷凝膠對燒傷創(chuàng)面修復的效應，以空白凝膠作為陰性對照，以表皮細

7、胞生長因子凝膠和磺胺嘧啶銀作為陽性對照。
　　 方法：(1)原代培養(yǎng)人成纖維細胞3例，取第2代用于實驗。選用含有10-6、10-5、10-4、10-3、10-2mol/L不同濃度虎杖苷的培養(yǎng)液作用于細胞72h，以未加虎杖苷的培養(yǎng)液作為對照。MTT法檢測細胞增殖情況；流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡；ELISA法檢測上清中FN、C0Ⅰ、C0Ⅲ的分泌情況；RT-PCR檢測FN、C0Ⅰ、C0ⅢmRNA的基因表達情況。(2)選用HaCat細

8、胞株，用含有10-6、10-5、10-4、10-4、10-2mol/L不同濃度虎杖苷的培養(yǎng)液作用于細胞72h，以未加虎杖苷的培養(yǎng)液作為對照。MTT法檢測細胞增殖情況；流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡；流式細胞儀檢測整合素β1的表達。(3)選用84只SD大鼠，于背部共復制168個深Ⅱ°燒傷創(chuàng)面，將其隨機分為低、中、高濃度虎杖苷凝膠組、表皮細胞生長因子凝膠組、磺胺嘧啶銀組及空白凝膠組。于傷后3天、7天、14天、痊愈、愈后1周及2周留取標本。觀察

9、各組動物愈合時間、不同時間創(chuàng)面愈合率。HE染色觀察創(chuàng)面愈合過程。中性粒細胞計數(shù)、Western Blotting檢測髓過氧化物酶(MPO)表達觀察炎性細胞浸潤情況。Masson染色、氯胺T法檢測羥脯氨酸含量觀察膠原合成情況。免疫組化CD31染色觀察新生血管形成情況。六胺銀染色觀察痊愈創(chuàng)面基底膜重建情況。微循環(huán)儀檢測不同時間段創(chuàng)面微循環(huán)的變化。(4)本實驗所用數(shù)據(jù)均用采x±s表示，用SPSS(13.0版)統(tǒng)計軟件包進行方差分析。
　

10、　 結果：
　　 (1)中低濃度虎杖苷對成纖維細胞有促增殖作用，10-5、10-4mol/L組作用最明顯。10-2mol/L組0A值大大下降，細胞生長受抑制。10-3mol/L組G1期細胞大幅度下降為83.09±4.42％，S期增至13.62±1.69％，細胞有S期阻滯現(xiàn)象。10-2mol/L組細胞凋亡率為85.39±11.74％，有明確的促凋亡作用。10-2mol/L組上清中C0Ⅰ、C0Ⅲ、FN的表達與其他各組比較均有統(tǒng)計學

11、差異。C0Ⅰ、C0Ⅲ分別為61.49±3.42μ g/ml、945.05±38.79ng/ml，較其他各組顯著性增高；FN為5.16±2.89ng/ml，較對照組顯著性增高，較其他各組有所下降。10-2mol/L組中C0Ⅰ、C0Ⅲ、FNmRNA的分別為0.902±0.074、0.847±0.337、0.597±0.317，10-2mol/L虎杖苷有抑制C0Ⅰ、C0Ⅲ、FNmRNA表達的作用。
　　 (2)中低濃度虎杖苷對角質生成

12、細胞有促增殖作用，10-4-10-3mol/L組作用最明顯。10-2mol/L組0A值大大下降，細胞生長受抑制。這種促增殖作用有時間相關性。各濃度組對細胞周期影響不大。10-2mol/L組細胞凋亡率為72.19±16.63%，有明確的促凋亡作用。細胞整合素β1的表達隨濃度升高逐漸增加，10-3mol/L組升至83.7±4.2％，10-2mol/L組大幅度下降至41.9±3.1％。
　　 (3)高濃度虎杖苷組(100μg/g)愈合

13、時間22.9±2.3天，較其他各組均有提前；7天、14天愈合率較高，愈合加快。3、7、14天各濃度虎杖苷組中性粒細胞計數(shù)均少于其他各組，Western Blotting檢測MPO表達情況與細胞計數(shù)一致。Masson染色顯示各濃度虎杖苷組膠原增生開始較早，排列整齊；磺胺嘧啶銀組膠原排列紊亂。氯胺T法測羥脯氨酸含量，其中磺胺嘧啶銀組膠原表達最活躍。免疫組化檢測CD31顯示高濃度虎杖苷組、表皮細胞生長因子組及磺胺嘧啶銀組新生血管密度高于其他各

14、組，并持續(xù)至創(chuàng)面愈合。六胺銀染色觀察基底膜情況各濃度虎杖苷組均有不同程度基底膜重建，其中高濃度虎杖苷組最佳。微循環(huán)觀察傷后外用高濃度虎杖苷凝膠有減輕水腫、改善微循環(huán)的作用。各濃度組傷后7天中心區(qū)血流有所恢復，14天見大量新生血管形成，至創(chuàng)面痊愈后1周，高濃度虎杖苷組血管接近正常水平，磺胺嘧啶銀組新生血管數(shù)量仍較多，且排列紊亂。
　　 結論：
　　 (1)10-5-10-4mol/L為最適促成纖維細胞增殖濃度，不影響細胞周

15、期及細胞外基質合成與分泌；10-3mol/L虎杖苷有S期阻滯作用；10-2mol/L組有明確的促凋亡作用，且抑制C0Ⅰ、C0Ⅲ、FNmRNA的表達。
　　 (2)10-5-10-3mol/L為最適促角質形成細胞增殖濃度，不影響細胞周期及凋亡，增加細胞表面整合素β1的表達；10-2mol/L組有明確的促凋亡作用，且抑制整合素β1的表達。
　　 (3)與空白凝膠陰性對照組及表皮細胞生長因子、磺胺嘧啶銀陽性對照組比較，高濃度虎

16、杖苷凝膠明顯縮短愈合天數(shù)，加速創(chuàng)面愈合速度。主要作用機理為一方面通過減輕水腫、改善局部微循環(huán)、減少局部炎性細胞浸潤、促進新生血管形成加速創(chuàng)面愈合；另一方面通過促進基底膜重建、調整膠原組織重塑改善愈合質量。
　　 全文小結：
　　 1.用細胞生物學和分子生物學方法，查明虎杖苷對燒傷創(chuàng)面兩種主要修復細胞(成纖維細胞和角質形成細胞)的生長增殖、表達合成、細胞凋亡的影響。
　　 2.確定10-5-10-4mol/L·為虎