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文檔簡介
1、由于 BirA 酶生物素化的能力,其作為一種重要的試劑已廣泛用于蛋白質(zhì)分子之間相互作用的研究,特別是細(xì)胞表面受體-配體相互作用的研究。
目的:構(gòu)建生物素-蛋白連接酶(BirA酶)基因的表達(dá)載體, 并在大腸桿菌 BL21 (DE3)中表達(dá)具有生物學(xué)活性的BirA酶。
方法:用PCR法擴增BirA酶基因。將PCR產(chǎn)物克隆入 pET32a 中構(gòu)建BirA酶-Trx融合蛋白基因的重組表達(dá)載體 pET32a–BirA。
2、經(jīng)測序驗證后, 在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá), 通過 SDS-PAGE 電泳初步檢測,篩選高表達(dá)菌株。對高表達(dá)菌株進行發(fā)酵罐高密度發(fā)酵表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物采用金屬螯和柱進行純化。以帶有生物素酶底物肽(BirA substrate peptide,BSP)的VR111-BSP蛋白為底物, 用ELISA鑒定表達(dá)產(chǎn)物的生物素化活性,并研究了BirA酶生物學(xué)活性。
結(jié)果:構(gòu)建了 pET32a–BirA 原核表達(dá)質(zhì)粒, 并在大腸
3、桿菌BL21 (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)分子量為51779的BirA酶-Trx融合蛋白。表達(dá)菌株在30升發(fā)酵罐上建立了高密度發(fā)酵工藝,發(fā)酵密度達(dá)到了80 g濕菌體/L發(fā)酵液,BirA酶表達(dá)量為2.62×107 U/g濕菌體。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)金屬螯和柱純化后, 得到N端帶有Trx標(biāo)簽的BirA 酶蛋白,純度大于90%。EL ISA的結(jié)果顯示, 表達(dá)產(chǎn)物能使底物VR111-BSP蛋白生物素化。并得到了BirA酶的米氏常數(shù)Km(19.4 μM/min)和
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