廣西瑤山亞種樹鼩TLR3基因克隆表達研究及生物信息學分析.pdf

1、目的：克隆廣西瑤山亞種樹鼩Toll樣受體3（Toll like receptor3,TLR3）基因的開放讀碼框（Open Reading Frame,ORF）序列，進行生物信息學分析。構建廣西瑤山亞種樹鼩TLR3基因ORF的原核表達載體，原核表達廣西瑤山亞種樹鼩Toll樣受體3重組蛋白。
　　方法:（1）參照滇西亞種TLR3 mRNA預測序列，用Vector NTI分析其ORF，并應用引物設計軟件Primer Premier5.0

2、針對樹鼩TLR3基因序列設計引物，且以廣西瑤山亞種樹鼩外周血總RNA為模板合成第一鏈cDNA。（2）設計九條特異性引物進行擴增得到目的片段，與融合表達載體PBET-4連接。將重組質粒PBET-4-TLR3 ORF轉入大腸桿菌DH5α，用含Amp的LB培養(yǎng)基篩出單克隆菌落，菌落PCR鑒定重組克隆分子量大小。（3）送測序，通過基因比對分析廣西瑤山亞種樹鼩TLR3基因ORF序列和預測滇西亞種樹鼩TLR3基因ORF序列的同源性，并對廣西瑤山亞種

3、樹鼩TLR3基因進行生物信息學分析。（4）提取重組質粒PBET-4-TLR3 ORF，將其轉入表達菌株DE3中，用IPTG誘導表達。蛋白變性后，制SDS-PAGE凝膠進行蛋白電泳，考馬斯亮藍染色再脫色，分析廣西瑤山亞種樹鼩Toll樣受體3重組蛋白表達情況。
　?。?）采用DNAMAN軟件對克隆得到的廣西瑤山亞種樹鼩TLR3基因ORF序列進行基因序列分析；用NCBI網站中的BLAST工具對廣西瑤山亞種樹鼩與其他物種的TLR3基因OR

4、F序列的進行同源性分析。采用Vector NTI軟件對廣西瑤山亞種樹鼩TLR3蛋白的氨基酸序列進行預測，并對廣西瑤山亞種樹鼩與滇西亞種樹鼩的TLR3基因ORF序列和氨基酸序列進行比對；通過軟件MEGA5.10繪制系統(tǒng)進化樹；使用（http://web.expasy.org/protscale/）在線軟件預測廣西瑤山亞種樹鼩TLR3蛋白的疏水性；使用（http://smart.embl-heidelberg.de/）在線軟件預測廣西瑤山亞

5、種樹鼩TLR3蛋白的關鍵結構域；用在線分析工具NetPhos2.0 Server對廣西瑤山亞種樹鼩TLR3蛋白的磷酸化位點進行預測。
　　結果：（1）經測序及綜合分析表明，構建原核表達載體PBET-4-TLR3 ORF的質粒連接正確，且廣西瑤山亞種樹鼩TLR3基因ORF序列全長為2757bp，A+T含量為59.15％，C+G含量占40.85%，編碼918個氨基酸；（2）轉有PBET-4-TLR3 ORF的DE3表達菌株經IPTG誘

6、導表達后，結果顯示廣西瑤山亞種樹鼩TLR3重組蛋白成功表達，分子大小為125kDa左右，與預期目的蛋白理論值基本符合。廣西瑤山亞種樹鼩TLR3蛋白分析結果顯示：分子量為105.3041kDa，等電點為8.31；疏水性分值在-3.0至4.0之間；該蛋白具有跨膜結構，且有19個關鍵結構域，其中胞內段為TIR結構，胞外段和胞內段分別有18個和1個關鍵結構域；還發(fā)現(xiàn)它具有37個磷酸化位點，其中含有3個蘇氨酸蛋白激酶磷酸化位點、8個絡氨酸蛋白激酶

7、磷酸化位點和27個絲氨酸蛋白激酶磷酸化位點。（3）對廣西瑤山亞種樹鼩TLR3基因ORF序列進行了生物信息學分析，如：基因序列比對顯示廣西瑤山亞種樹鼩與滇西亞種樹鼩的TLR3基因序列相似性最高，為98.33%，但仍有差異；與人、黑猩猩、獼猴、狗、豬的相似性次之，為84.75%、84.71%、84.50%、84.48%、84.84%,與嚙齒類動物的相似性最低。通過氨基酸序列同源性比對，發(fā)現(xiàn)廣西瑤山亞種與滇西亞種樹鼩TLR3屬于同一個類群，與

8、獼猴、黑猩猩和人的距離近，證實廣西瑤山亞種樹鼩接近于靈長類動物；
　　結論與意義：首次成功克隆廣西瑤山亞種樹鼩TLR3基因ORF序列，并成功構建原核表達載體PBET-4-TLR3 ORF，誘導其在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得表達出分子量大小約125kDa左右的特異性條帶蛋白。廣西瑤山亞種樹鼩和滇西亞種樹鼩TLR3蛋白有11個氨基酸不同，因此二者TLR3在抗原性方面可能有所不同。本研究為后續(xù)廣西瑤山亞種樹鼩TLR3基因的熒光定量