人腸三葉因子分泌型真核表達載體的構建及在CHO細胞中表達實驗.pdf

1、目的：
　　 克隆人腸三葉因子(humanintestinaltrefoilfactor,hITF)基因片段，構建hITF分泌型真核表達載體并將其轉染入二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細胞(CHO/dhfr-);G418篩選獲得穩(wěn)定表達的細胞株；用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)檢測其在細胞培養(yǎng)上清液中的表達，為進一步重組hITF的臨床前研究奠定良好的實驗基礎

2、。
　　 方法：
　　 1．自行設計上下游各帶有NheI和EcoRI限制性酶切位點的PCR引物，通過重疊延伸PCR法(splicingbyoverlapextensionPCR,SOE-PCR)獲得hITF基因片段，用限制性核酸內切酶NheI和EcoRI分別雙酶切真核載體質粒pIRES/dhfr和目的基因hITF片段，用T4DNA連接酶連接pIRES/dhfr質粒和hITF片段，將連接產物轉化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞

3、中，在含有終濃度為100mg/mL氨芐西林(Ampicillin，Amp)的LB固體培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)過夜后，挑取單個陽性菌落擴增，提取并純化重組載體質粒pIRES/hITF/dhfr。
　　 2．用限制性核酸內切酶雙酶切和DNA測序鑒定所構建重組載體pIRES/hITF/dhfr。
　　 3．LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑介導轉染CHO/dhfr-細胞，隨機分為三個組：正常對照組、空載體質粒組和重組

4、質粒組。
　　 4．轉染后48h，用700μg/mLG418加壓篩選2周，從而獲得穩(wěn)定的轉染細胞。
　　 5．提取空載體質粒組和重組質粒組細胞的總RNA，通過RT-PCR檢測hITF在CHO/dhfr-細胞中的轉錄情況。
　　 6．雙抗體夾心ELISA法檢測未轉染細胞上清液、空載體質粒組和重組質粒組細胞上清液中hITF表達情況。
　　 結果：
　　 1．成功獲得300bp左右的hITF基因，測序結

5、果證明了hITF基因序列與GenBank中報道的序列相一致。
　　 2．成功構建hITF分泌型真核表達載體pIRES/hITF/dhfr，將此重組質粒轉染CHO/dhfr-細胞。
　　 3．RT-PCR,后電泳結果顯示重組質粒組在300bp左右處出現(xiàn)陽性條帶，而空載體質粒組未見條帶。
　　 4．雙抗體夾心ELISA法檢測到重組質粒組細胞上清液中有hITF的表達，而未轉染細胞上清和空載體質粒組細胞上清液中均未檢測到