基于ITS2條形碼和代謝組學技術的藏藥獨一味品質評價研究.pdf

1、獨一味（Lamiophlomis rotata(Benth.)Kudo）為唇形科獨一屬植物，收載于《月王藥診》，是藏、蒙、納西等民族的民間草藥,《中國藥典》收錄其功用為“活血祛瘀，止血鎮(zhèn)痛”，獨一味的止血鎮(zhèn)痛作用是近幾十年民間對其應用總結的結果，獨一味制劑臨床主要用于多種外科手術后的刀口疼痛、出血等疾病的治療，療效確切，且安全性好。
　　獨一味別名達布巴、吉布孜、達干木、達知合巴等，傳統(tǒng)藏醫(yī)藥理論中主要用于“黃水病”的治療，達布巴

2、的來源有三種：唇形科獨一味屬植物獨一味Lamiophlomis rotata(Benth.) Kudo，唇形科筋骨草屬植物美花圓葉筋骨草Ajuga ovalifolia Bur.et Franch.var.calantha(Diels) C.Y.Wu et C.Chen以及玄參科藏玄參屬植物藏玄參Oreosolen wartii Hook.f。三種植物均分布在高海拔地區(qū)，植物形態(tài)相似，易于混淆，不同產地的“達布巴”藥材，存在習用名稱、藥

3、材基源、分布狀態(tài)等顯著差異，獨一味與“達布巴”在不同醫(yī)療體系功能主治不同，且臨床使用量較大，但較少對代用品的進行相關研究，難以確保獨一味藥材的用藥安全規(guī)范。
　　目的：
　　為準確鑒別中藥材獨一味及其習用品，應用ITS2條形碼技術對不同產地的40份藥材及其習用品進行鑒定研究。采用多種層析手段對進行系統(tǒng)分離的。并選取具有代表性產地來源的獨一味樣品進行HPLC-DAD-TOF/MS分析，初步鑒定獨一味中主要的代謝產物。研究四個主

4、要產地獨一味藥材差異。采用1H-NMR代謝物組學技術，對不同產地的樣品的初生和次生代謝產物進行多變量分析研究。為了進一步發(fā)現(xiàn)獨一味組成成分藥理活性，采用體外活性測試化合物單體的活性。
　　方法：
　　1、廣泛收集獨一味、美花圓葉筋骨草藥材不同產地的40個樣品，利用PCR測序法，采用核基因ITS2片段擴增，雙向測序樣品，CodonCode Aligner拼接序列，數(shù)據(jù)用MEGA4.0進行分析，構建鄰接（NJ）樹。
　　2

5、、綜合利用硅膠柱層析、反相硅膠和分子排阻色譜法對獨一味水提物組成成分進行系統(tǒng)分離，結合UV、MS、1H-NMR和13C-NMR等光譜數(shù)據(jù)對分離得到的化合物進行結果鑒定；利用HPLC-DAD-TOF/MS聯(lián)用技術對獨一味中化學成分進行了快速定性分析。
　　3、采用1H-NMR代謝物組學技術，檢測分析獨一味藥材中的初生和次生代謝成分，結合主成分分析（PCA）、HCA方法研究甘肅、西藏、青海和四川等主要產地獨一味藥材代謝成分組成差異；綜

6、合利用核磁氫譜化學位移、液質聯(lián)用保留時間、質荷比等參數(shù)發(fā)現(xiàn)不同產地獨一味藥材的主要代謝產物。采用HPLC-DAD定量測定不同產地獨一味藥材中6個主要次生代謝產物的含量，評價與NMR代謝組學檢測的一致性。
　　4、研究獨一味對血小板活性功能影響，采用比濁法檢測ADP誘導的血小板聚集功能，選擇獨一味為研究對象，對從獨一味中分析發(fā)現(xiàn)的一系列主要代謝產物進行分析。
　　結果：
　　1、獨一味ITS2序列長度均為219bp，其種

7、內平均K2P（Kimura-2-parameter）遺傳距離為0.0197，遠小于其代用品的種間平均K2P遺傳距離。ITS2序列作為DNA條形碼可以方便快捷地鑒別獨一味及其代用品，為其種質資源鑒定及臨床安全用藥提供了重要分子依據(jù)。
　　2、對獨一味中化學成分進行了快速定性分析，得到各化合物的總離子流圖和多級質譜圖，從而對各色譜峰進行鑒定。采用Waters Symmetry色譜柱，以甲醇-0.1％甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，綜合

8、各組分在色譜過程中的保留時間、分子離子分、質譜裂解離子碎片數(shù)據(jù)，結合參考文獻數(shù)據(jù)分析，從藥材中的24種化學成分，其中環(huán)烯醚萜苷類14個，苯乙醇苷類7個，黃酮類化合物3個。本研究對獨一味藥效物質基礎研究、質量控制及其臨床用藥具有一定的指導意義。
　　3、檢測分析甘肅、青海、西藏產區(qū)獨一味藥材的整體代謝成分，共鑒定出19個代謝產物，其中：9個環(huán)烯醚萜苷類，4個苯丙素類，5個糖類和1個脂肪酸類化合物。核磁共振氫譜（1H-NMR）結合模式

9、識別分析，判別出不同產區(qū)獨一味之間的代謝產物存在顯著的差異性。通過PCA載荷圖篩查分析發(fā)現(xiàn)，甘肅地區(qū)的獨一味樣品中環(huán)烯醚萜苷類化合物較青海和西藏獨一味樣品中高，而苯乙醇苷類化合物較青海和西藏兩個產地樣品中低；西藏地區(qū)樣品中苯乙醇苷類化合物在三個區(qū)域樣品中相對最高。采用聚類分析Hierarchical cluster analysis（HCA）與PCA分析結果相同，其中組間差異最大的為來自西藏的樣品，青海與甘肅樣品較為接近。HPLC-DA

10、D法顯示本文建立的NMR方法與常規(guī)分析方法的定量結果基本一致。
　　4、通過研究其對ADP誘導的血小板聚集功能的影響，發(fā)現(xiàn)9個化合物均表現(xiàn)有一定的抗ADP誘導血小板聚集作用，抗ADP誘導血小板聚集強度依次為連翹酯苷B＞毛蕊花糖苷＞Alyssonoside＞木犀草苷＞7,8-dehydropenstemoside＞Phlorigidoside C＞山梔苷甲酯＞8-O-乙酰山梔苷甲酯。
　　結論：
　　1、獨一味與美花圓葉

11、筋骨草和藏玄參的ITS2條形碼存在明顯的差異，可以作為獨一味及其代用品種的特征性條形碼，不同產地的獨一味樣品的ITS2條形碼有一定的差異，青海和四川產地樣品差異性較小，甘肅產地樣品與西藏產地樣品差異性較大。
　　2、1H NMR方法的供試品溶液制備和樣品測定耗時短，適用性強，重復性好,可快速鑒別不同產的獨一味樣品組成成分差異，鑒定結果與獨一味樣品的ITS2條形碼NJ樹分析結果有較強的相似性，與常規(guī)HPLC-DAD分析方法結果基本一

12、致。
　　3、結合1H NMR和TOF/MS代謝組學方法，綜合利用核磁氫譜化學位移、液質聯(lián)用保留時間、質荷比共鑒定出藥材中共有9個代謝成分。
　　4、9個化合物均表現(xiàn)有一定的抗ADP誘導血小板聚集作用，獨一味“止血祛瘀，活血鎮(zhèn)痛”功用的是9個代謝標志物共同作用的結果。
　　創(chuàng)新點：1）本文針對獨一味藥質量控制和評價方法的局限性，應用DNA條形碼技術，采用1H-NMR代謝物組學和LC-TOF-MS技術，從學術思想、研究思

13、路及分析方法等方面探索了藏藥獨一味品種鑒定、質量評價研究的新模式。
　?。?）本文首次采用ITS2序列的DNA條形碼技術鑒定獨一味、美花圓葉筋骨草和藏玄參，實驗證明ITS2序列可準確區(qū)分出獨一味及其習用品種的差異，盡管樣品來源復雜（包括課題組采集、市場購買，甚至包括不同存放年限），仍然可以通過ITS2序列將獨一味與其習用品區(qū)分開，相關研究結果應用于《中國藥典》獨一味藥材DAN條形碼標準序列。
　?。?）本文通過HPLC-TO

14、F-MS及LC-MSn技術對獨一味中三類主要成分：首次總結24個化學成分的質譜裂解規(guī)律，環(huán)烯醚萜、黃酮、苯乙醇苷類同時進行分離鑒定，比較全面地闡明了獨一味的化學組成，為獨一味的藥效物質基礎研究和質量控制奠定了基礎。
　?。?）本文首次利用1H-NMR的代謝物組學技術研究不同產地的獨一味Lamio phlomis rotata(Benth.)Kudo成分差異和標志性代謝產物差異，鑒定的差異性化學成分可以作為潛在的化學標志物用于獨一味