PAMAM-HA靶向基因藥物傳遞系統(tǒng)構(gòu)建及生物性能的評(píng)價(jià).pdf

1、基因治療是通過一定的方法、方式，將外源基因?qū)肽康募?xì)胞并使其有效表達(dá)，以糾正基因的缺陷或在細(xì)胞中發(fā)揮作用，從而發(fā)揮治療疾病的作用?；蛑委煹年P(guān)鍵就是選擇合適的載體將目的基因準(zhǔn)確的運(yùn)送到靶細(xì)胞，并控制使其有效表達(dá)，發(fā)揮治療作用。病毒型載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但病毒載體存在較嚴(yán)重的安全性問題。非病毒載體主要有陽(yáng)離子聚合物、陽(yáng)離子多肽和陽(yáng)離子脂質(zhì)體等，具有靶向性，低細(xì)胞毒性，較高的安全性，并且易于進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾等優(yōu)點(diǎn)，已成為基因治療中的熱點(diǎn)，逐

2、漸受到了越來(lái)越多的關(guān)注，對(duì)其研究已逐漸深入。PAMAM具有內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)，其末端基團(tuán)精確可控，氨基易質(zhì)子化而帶正電，容易與DNA結(jié)合形成納米級(jí)復(fù)合物，可以保護(hù)DNA并達(dá)到轉(zhuǎn)染的目的，作為藥物載體和基因載體具有較高的穩(wěn)定性、生物兼容性良好、無(wú)免疫源性、使用劑量下低細(xì)胞毒性的優(yōu)勢(shì)。對(duì)PAMAM樹狀大分子末端基團(tuán)進(jìn)行表面修飾，減少表面的正電荷數(shù)目，以降低其細(xì)胞毒性，改善基因轉(zhuǎn)染效率。透明質(zhì)酸（Hyaluronic,簡(jiǎn)稱HA）作為天然水溶性高分子

3、，具有多種適宜作為作為藥物載體的優(yōu)良特性，包括生物兼容性良好、非免疫原性、高生物活性及易被體內(nèi)酶作用而天然降解、靶向性。本研究以HA具有較好的腫瘤靶向性、增強(qiáng)復(fù)合物水溶性、生物兼容性，PAMAM具有較好的攜帶目的基因?qū)爰?xì)胞中的理論基礎(chǔ)為切入點(diǎn)，擬構(gòu)建HA-PAMAM/pEGFP基因傳遞表達(dá)系統(tǒng)，深入研究其物理化學(xué)性能、生物性能、靶向性等方面的影響；從PAMAM分子量，HA接枝率和接枝密度，聚陽(yáng)離子/基因重量比（w/w）等方面優(yōu)化該傳遞

4、系統(tǒng)，提高基因轉(zhuǎn)染效率、降低細(xì)胞毒性、提高載體靶向性、穩(wěn)定性等。
　　本研究的主要內(nèi)容：
　　（1）PAMAM-HA聚合物的化學(xué)合成和結(jié)構(gòu)表征：采用透明質(zhì)酸（HA）與PAMAM在含有NaCl的四氫硼酸鈉（NaBH4）緩沖液中（pH8.5），在氰硼氫化納（NaBH3CN）催化下反應(yīng)生成PAMA-HA聚合物。不同PAMAM分子量、HA接枝量和接枝密度的PAMAM-HA樣品同步制備并作比較。PAMAM-HA樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)有紅外（I

5、R）等鑒定。
　?。?）對(duì)PAMAM-HA作為基因載體的性能考察：采用動(dòng)態(tài)光散射發(fā)測(cè)定了PAMAM-HA/DNA復(fù)合物的粒徑分布及表面電位；采用透射電鏡（TEM）觀察復(fù)合物粒子形態(tài)；通過瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)考察PAMAM-HA結(jié)合并壓縮DNA的能力。
　?。?）PAMAM-HA細(xì)胞毒性：用MTT法考察PAMAM-HA各樣品對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并考察在PAMAM-HA/DNA的轉(zhuǎn)染比例下的毒性。
　?。?）PAMAM

6、-HA體外轉(zhuǎn)染研究：用Bel-7402細(xì)胞對(duì)PAMAM-HA/DNA復(fù)合物的最佳轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行篩選并考察PAMAM-HA/DNA復(fù)合物在不同細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)染與PEI25K相比較，同時(shí)考察血清對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。
　?。?）PAMAM-HA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡法考察PAMAM-HA各樣品在在實(shí)驗(yàn)濃度下是否可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及凋亡效率與濃度和時(shí)間的關(guān)系。
　?。?）PAMAM-HA轉(zhuǎn)染機(jī)制研究：用不同攝取途