骨髓間充質干細胞調控MAPK-NF-κB信號通路糾正實驗性IBD小鼠免疫失衡的機制研究.pdf

1、研究背景:
　　炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是合并有多種腸外表現(xiàn)的消化道疾病的腸道炎癥性疾病，本病以反復發(fā)作的慢性炎癥為主要的病理表現(xiàn)，目前其發(fā)病的機制仍不完全明確。根據其病理和臨床表現(xiàn)的不同，醫(yī)學工作者將其分為三種:潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis，UC)、克羅恩病(Crohn's Disease,CD)、以及尚未明確類型的未定型IBD。骨髓間充質干細胞是成體干細胞

2、家族中的一員，并且最早經人工分離出來，具有較低的基本不引起免疫反應的免疫原性、向多種成體細胞分化的潛能同時還能夠發(fā)揮調節(jié)免疫失衡的作用等優(yōu)點，因此常常被用來體內移植治療相關疾病，以IBD為例，因BMMSCs可以對發(fā)生充血水腫以及糜爛潰瘍的腸道黏膜進行修復同時還能夠失機體及局部的失衡的免疫功能恢復平衡，而成為治療本病的首選細胞。然而，BMMSCs移植抑制炎癥進展機制尚不明確。由于MAPK/NF-κB信號傳導通路與Th1/Th2免疫細胞相關

3、的免疫反應密切相關，且對IBD的發(fā)生與進展發(fā)揮著至關重要的作用。因此研究骨髓間充質干細胞調控MAPK/NF-κB信號通路靶點糾正實驗性IBD小鼠免疫失衡的機制具有重要的意義。
　　研究目的:
　　通過移植BMMSCs在治療實驗性IBD小鼠，進一步檢測BMMSCs在小鼠模型中發(fā)揮的免疫調節(jié)作用，同時在篩查關鍵基因的基礎上探討B(tài)MMSCs如何通過MAPK/NF-κB信號通路靶點來發(fā)揮糾正實驗性IBD小鼠免疫失衡的具體機制，從而為

4、干細胞的臨床應用提供理論依據支持。
　　實驗內容:
　　1、構建并鑒定BMMSCs。
　　2、檢測BMMSCs在IBD小鼠體內的免疫調節(jié)作用及篩查MAPK/NF-κB信號通路相關的差異基因
　　3、在IBD小鼠體內中正反驗證差異基因的調節(jié)機制
　　研究方法:
　　1、選用3天的BALB／c雄性乳鼠采用全骨髓加碎骨片法分離并體外培養(yǎng)BMMSCs從而獲得純度較高的BMMSCs。
　　2、通過觀察BM

5、MSCs的細胞形態(tài)、對細胞表面標志物檢測以及誘導分化對培養(yǎng)的細胞進行檢測和鑒別。
　　3、選擇6-8周齡左右的成年BALB/c雌性小鼠，隨機分為空白對照組、造模組和治療組:①對照組（C組）:用生理鹽水給小鼠灌腸，每只0.1ml，灌腸后垂直1分鐘后放入飼養(yǎng)籠中，每7天灌腸一次，連續(xù)灌腸四次，最后一次灌腸后次日，通過尾靜脈注射0.1ml純PBS液體，n=30;②造模組（T組）:用現(xiàn)配的灌腸劑（TNBS2.0mg/50％乙醇）給小鼠灌腸

6、，通過靜脈留置針軟管給予造模組每只小鼠0.1ml的灌腸劑，垂懸1分鐘后放入飼養(yǎng)籠中，每7天灌腸一次，連續(xù)灌腸四次，最后一次灌腸后的次日，通過尾靜脈注射0.1ml純的PBS液體，n=40;③治療組（M組）:用TNBS2.0mg/50％乙醇灌腸劑給小鼠灌腸，每只0.1ml，垂直1分鐘后放入飼養(yǎng)籠中，每7天灌腸一次，連續(xù)灌腸四次，最后一次灌腸后第2天，通過尾靜脈注射0.1ml含有1×106個培養(yǎng)至第三代的純度較高的BMMSCs的PBS，n=4

7、0;
　　4、觀察三組小鼠的精神、活躍度等一般狀況、體重變化等，并進行臨床癥狀評分、肉眼及鏡下對腸道大體及組織學表現(xiàn)進行觀察和評估。
　　5、分別于從當日起，按照間隔兩日的時間規(guī)律，連續(xù)留取小鼠血液及組織學（腸道、脾臟）標本，直至第十三天，所獲得的標本經處理后進行保存。
　　6、采用免疫組化檢測腸道上皮間的Occludin緊密連接蛋白和VEGF的表達情況。
　　7、制備小鼠脾細胞單細胞懸液并利用流式細胞儀檢測Th

8、1/Th2細胞比例并利用QPCR和微量樣本多指標流式蛋白定量技術(CBA)檢測IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10細胞因子的表達。
　　8、利用小鼠Roche NimbleGen基因表達12×135K芯片和全局信號轉導網絡篩查分析差異基因。
　　9、利用基因芯片以及信號轉導網絡篩選出的有效差異基因MAPK13構建其慢病毒載體和siRNA使增強抑制其表達。
　　10、將轉染慢病毒和siRNA的BMMSCs移植入IB

9、D小鼠模型體內進行相關驗證。
　　研究結果:
　　1、采用骨髓加碎骨片法培養(yǎng)的BMMSCs鏡下觀察細胞成纖維狀形態(tài)均一，密集排列，細胞表面特異性抗原標志物檢測顯示:陽性表達標志物CD90.2;CD105;陰性表達標志物CD45-;CD11b-;成骨誘導后鏡下可見明顯的骨結節(jié)形成，成脂肪細胞誘導后鏡下可見脂肪滴。
　　2、TNBS2.0mg/50％乙醇灌腸法誘導后的實驗性IBD小鼠模型的一般狀態(tài)較差，死亡率提高，臨床癥狀

10、評分以及HE染色后的組織學評分較空白組小鼠出現(xiàn)上升的趨勢，且差異有統(tǒng)計學意義。取標本后大體觀察可見腸壁明顯增厚并出現(xiàn)一定的短縮，局部腸段因慢性炎癥的累積形成纖維化而出現(xiàn)腸腔縮窄，腸黏膜出現(xiàn)輕重不一的充血、水腫，黏膜及黏膜下層有中性粒、淋巴細胞等炎性細胞浸潤，與空白對照組（C組）比較均出現(xiàn)差異(p＜0.05);與造模組（T組）相比，治療組（M組）移植后第2天起，小鼠死亡率下降，DAI及HE染色后的組織病理學鏡下評分出現(xiàn)下降(p＜0.05)

11、。
　　3、BMMSCs移植后免疫細胞檢測結果提示:造模組（T組）小鼠Th1細胞比例是17.95％，治療后Th1細胞比例是12.18％，出現(xiàn)明顯的下調，而造模組小鼠Th2細胞比例是0.88％，治療后Th2細胞比例是0.67％，沒有明顯的變化。
　　4、BMMSCs移植后免疫因子檢測結果提示:與對照組（C組）相比，促炎因子IL-2、TNF-α水平在T組上升分別于第3天和第5天達到最高(p＜0.01)，而后逐漸下降。在M組中，促

12、炎因子IL-2、TNF-α水平均于治療后第3天開始逐漸下降(p＜0.01)。與對照組（C組）相比，抑炎因子IL-10水平在T組中無明顯變化，M組中一直處于上升趨勢。
　　5、將轉染MAPK13慢病毒和siRNA的BMMSCs分別移植入IBD小鼠模型進行免疫細胞檢測:普通BMMSCs治療組（a組）小鼠Th1細胞比例是11.10％，MAPK13基因過表達的BMMSCs治療組（b組）小鼠Th1細胞比例是22.47％，MAPK13基因si

13、RNA干擾的BMMSCs組（c組）10.11％。而普通BMMSCs治療組（a組）小鼠Th2細胞比例是0.53％，MAPK13基因過表達的BMMSCs治療組（b組）小鼠Th2細胞比例是0.44％，MAPK13基因siRNA干擾的BMMSCs組（c組）2.82％。
　　6、將轉染MAPK13慢病毒和siRNA的BMMSCs分別移植入IBD小鼠模型進行免疫因子檢測:(1)與普通BMMSCs組（a組）相比，MAPK13基因過表達的BMMS

14、Cs組（b組）TNF-a水平于尾靜脈注射治療第1天上升不明顯，第3天時TNF-a水平達到最高(p＜0.01);MAPK13-siRNA干擾的BMMSCs組（c組），TNF-a水平在移植后的三天內呈現(xiàn)下降的趨勢。(2)與普通BMMSCs組（a組）相比，MAPK13基因過表達的BMMSCs組（b組）IL-2水平于尾靜脈移植治療后第1天開始上升，到移植后第3天時IL-2水平達到最高(p＜0.01)。MAPK13基因siRNA干擾的BMMSCs

15、組（c組）IL-2炎癥在三天內呈下降趨勢。(3)與普通BMMSCs組（a組）相比MAPK13基因過表達的BMMSCs組（b組）IL-10水平于尾靜脈注射治療第1-3天上升不明顯，抑炎因子IL-10水平沒有明顯的差異(p＞0.05)，而MAPK13基因siRNA干擾的BMMSCs組（c組）IL-10在移植后的三天內呈現(xiàn)上升的趨勢，與普通BMMSCs相比有明顯的差異(p＜0.01)。
　　研究結論:
　　1、BMMSCs移植可以