家族性高膽固醇血癥樣表型兩家系候選基因分析.pdf

1、[目的]
　　家族性高膽固醇血癥(familial hypercholesterlolemia,FH)是一種常見的常染色體單基因顯性遺傳性疾病,是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和早發(fā)冠心病的最重要危險(xiǎn)因素。本研究以臨床確診重型FH的2個(gè)漢族家系為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,針對(duì)低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein-receptor,LDL-R)基因和FH新發(fā)現(xiàn)的致病基因蛋白轉(zhuǎn)化酶---枯草溶菌素9(proprotein convert

2、ase subtilisin/kexin type9,PCSK9)基因,應(yīng)用最新的毛細(xì)管電泳和新基因的微衛(wèi)星位點(diǎn),進(jìn)行連鎖分析,對(duì)候選基因進(jìn)行核苷酸序列分析,最終發(fā)現(xiàn)突變,旨在建立一種快速的初篩方法,進(jìn)而在漢族FH家系中進(jìn)行基因定位,為FH人群的早期診斷和干預(yù)、預(yù)防冠心病和未來的基因治療積累經(jīng)驗(yàn)。
　　[方法]
　　本研究主要分為三部分:1.根據(jù)荷蘭脂質(zhì)臨床指南(Dutch Lipid Clinic Network)1999

3、年制定的臨床診斷FH標(biāo)準(zhǔn)入選FH家系,進(jìn)行家系采集工作,對(duì)先證者進(jìn)行心電圖、頸動(dòng)脈超聲、超聲心動(dòng)圖及腺苷負(fù)荷試驗(yàn),和冠脈血流儲(chǔ)備情況的相關(guān)檢查,對(duì)所有家系成員進(jìn)行血脂檢查和家族史調(diào)查,所有成員簽署知情同意書。根據(jù)家系采集的結(jié)果和臨床檢查的結(jié)果,繪制家系圖,進(jìn)行遺傳學(xué)分析,為家系連鎖分析作準(zhǔn)備。2.配置細(xì)胞裂解液,采用酚-氯仿法從所有家系成員全血中提取基因組DNA。首先常規(guī)檢測(cè)2名先證者ApoB100基因包括Q3500R、R3531C和R

4、3501W位點(diǎn)在內(nèi)的片段是否存在突變,以排除患家族性 ApoB100缺陷癥的可能性。然后對(duì)所有家系成員的DNA進(jìn)行定量檢測(cè)濃度,針對(duì)LDL-R基因和新的致病基因PCSK9,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增選擇的微衛(wèi)星位點(diǎn),并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化,應(yīng)用新型毛細(xì)管電泳進(jìn)行連鎖分析,根據(jù) LOD值初步確定患者的易感基因。3.參照我室建立的Touchdown PCR方法擴(kuò)增LDL-R基因全部18個(gè)外顯子和17個(gè)內(nèi)含子;參照國(guó)外文獻(xiàn)(Steve E,Med

5、Genet.2006)擴(kuò)增PCSK9基因全部12個(gè)外顯子;瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物片斷,并送交上海生工生物公司和上?；导夹g(shù)有限公司,對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列分析,與GenBank比對(duì)分析突變位點(diǎn)和性質(zhì),從而早期基因診斷患者。
　　[結(jié)果]
　　本研究的結(jié)果也分為三部分:1.根據(jù)Dutch Lipid Clinic Network1999年制定的臨床診斷FH標(biāo)準(zhǔn)入選了2個(gè)河南FH家系,共83人。其中河南1號(hào)家系中血脂異常者共1

6、1人,先證者同胞兄弟14歲時(shí)死于―黃瘤病‖。先證者心電圖示電軸左偏,左心室高電壓,V3-V5ST段下斜性壓低;超聲心動(dòng)圖可見左室擴(kuò)大,二尖瓣關(guān)閉不全(中度);腺苷負(fù)荷試驗(yàn)陽性;冠脈血流儲(chǔ)備減低。B超顯示雙側(cè)頸動(dòng)脈、雙側(cè)椎動(dòng)脈起始段內(nèi)膜彌漫增厚;右鎖骨下動(dòng)脈起始處斑塊。河南2號(hào)家系中血脂異常者共16人,先證者表姨媽15歲時(shí)死于心肌梗死。先證者心電圖顯示竇性心律,無明顯ST-T改變,大致正常心電圖。超聲心動(dòng)圖可見左室大,二尖瓣輕度返流,未見

7、瓣膜鈣化;腺苷負(fù)荷試驗(yàn)及冠脈血流儲(chǔ)備未見異常。B超顯示雙側(cè)頸動(dòng)脈、雙側(cè)椎動(dòng)脈起始段內(nèi)膜彌漫增厚。2.經(jīng)檢測(cè)2名先證者均可排除患家族性ApoB100缺陷癥的可能性。連鎖分析發(fā)現(xiàn)河南1號(hào)先證者的致病基因與LDL-R基因連鎖,可能與PCSK9基因連鎖,但可能性很小。河南2號(hào)先證者致病基因與LDL-R基因和PCSK9基因均不連鎖。3.核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn)河南1號(hào)先證者LDL-R基因第2外顯子發(fā)生Q12X突變,第97位堿基C→T改變,氨基酸由谷氨酰

8、胺變?yōu)榻K止密碼子,為雜合終止突變。其父親,大姑,四姑,五姑也發(fā)現(xiàn)同樣突變。經(jīng)檢索英國(guó)FH突變數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ucl.ac.uk/fh),該突變?cè)谝獯罄?法國(guó),土耳其人種已有報(bào)道,但在中國(guó)未見報(bào)道。故認(rèn)為河南1號(hào)先證者的LDL-R基因發(fā)生的Q12X突變是中國(guó)一例新的突變,由于是終止突變,因此也是致病性突變。河南2號(hào)家系先證者經(jīng)核苷酸序列分析,并未發(fā)現(xiàn)已知基因突變,我們推測(cè)可能存在其他未知的致病基因。
　　[結(jié)論]
　　1.兩名

9、先證者均符合FH的臨床診斷,動(dòng)脈硬化程度嚴(yán)重。
　　2.兩名患者ApoB100基因包括Q3500R、R3531C和R3501W位點(diǎn)在內(nèi)的片段未見突變,可排除患家族性ApoB100缺陷癥可能性。
　　3.河南1號(hào)家系:連鎖分析發(fā)現(xiàn)其致病基因與LDL-R基因連鎖,可能與PCSK9基因連鎖;核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn)LDL-R基因第2外顯子97位點(diǎn)C→T雜合終止突變(Q12X),并且在其父親和姑姑們中均發(fā)現(xiàn)該突變,Q12X為中國(guó)新的突變,