白細(xì)胞介素-27抑制炎癥作用的機(jī)制研究.pdf

1、本論文分為兩個部分，分別研究了白細(xì)胞介素-27對腸炎相關(guān)腸癌的保護(hù)作用和白細(xì)胞介素-27對小鼠肥胖模型的調(diào)控作用及其機(jī)制。
　　第一部分白細(xì)胞介素-27通過抑制腸上皮細(xì)胞分泌的促炎因子對腸炎相關(guān)腸癌的保護(hù)作用
　　炎癥和癌癥的相關(guān)性一直是腫瘤免疫的研究重點(diǎn)之一，以往的結(jié)果表明，長期的炎性環(huán)境會加速腫瘤的形成。腸炎相關(guān)腸癌是一種典型的炎癥相關(guān)腫瘤，長期的腸道炎癥導(dǎo)致腸上皮的不斷破壞和修復(fù)，長此以往加速了相關(guān)癌癥相關(guān)基因的突變頻

2、率和腫瘤細(xì)胞的增殖。白細(xì)胞介素-27（Interleukin-27，IL-27）由p28和EBI3兩個亞基組成，主要由活化的抗原遞呈細(xì)胞分泌，其受體由gp130和WSX-1兩個亞基組成，表達(dá)于多種免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞表面。已有文獻(xiàn)報道，IL-27在各種炎癥相關(guān)的疾病中發(fā)揮調(diào)控功能，并且在不同疾病模型中針對不同靶細(xì)胞兼有抑炎和促炎兩方面的作用。在腸炎的研究中，IL-27的功能也尚有爭議，兼有其促進(jìn)腸炎和抑制腸炎的報道，并且目前尚未

3、有關(guān)于IL-27在腸炎相關(guān)腸癌中功能的報道。因此，本文通過建立由AOM/DSS誘導(dǎo)的腸炎相關(guān)腸癌(colitis-associated cancer)小鼠模型，研究IL-27對腸癌發(fā)生發(fā)展的作用，以期為炎癥與癌癥的關(guān)系研究提供相關(guān)的理論依據(jù)，為腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子的作用增添新的認(rèn)識。
　　我們首先用野生C57BL/6小鼠成功構(gòu)建了AOM/DSS模型，取小鼠結(jié)直腸腫瘤和癌旁組織，及健康小鼠結(jié)直腸組織，通過熒光定量PCR(Q-PCR

4、)、Western Blot以及免疫熒光等手段檢測到IL-27的兩個亞基及其特異性受體亞基WSX-1在腫瘤組織局部表達(dá)升高，并且IL-27主要在腸道固有層細(xì)胞中表達(dá)。隨后，我們使用IL-27R受體亞基WSX-1敲除的(WSX-1 KO)小鼠和野生(WT)小鼠同時構(gòu)建AOM/DSS模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生小鼠相比，WSX-1 KO小鼠腸道腫瘤載量和數(shù)目明顯增多，局部的腫瘤細(xì)胞增殖加強(qiáng)，并且伴隨著促炎因子升高、腸道長度縮短等更嚴(yán)重的腸道炎癥指標(biāo)

5、。
　　為研究上述結(jié)果的機(jī)制，基于我們在WT和WSX-1 KO小鼠組織中觀察到了不同的炎癥程度，我們進(jìn)一步使用流式細(xì)胞術(shù)檢測了腸癌模型小鼠的腸道固有層細(xì)胞中的免疫細(xì)胞亞群的分布和變化，結(jié)果顯示促腫瘤生長的髓系來源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)在WSX-1 KO小鼠的腸道中明顯聚集增加，但其表面關(guān)鍵趨化因子受體CXCR2的表達(dá)并沒有明顯變化。我們進(jìn)一步檢測了腸上皮細(xì)胞中的趨

6、化因子和促炎因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在WSX-1 KO腸癌模型小鼠的腸上皮中，除CXCR2的配體CXCL1的表達(dá)明顯升高以外，促炎因子IL-6，TNF-α，GM-CSF的水平也有了明顯升高，提示了IL-27對腸上皮細(xì)胞可能發(fā)揮的抑炎作用。同時，免疫熒光實(shí)驗(yàn)也證明腫瘤局部CXCL1的下降與MDSCs數(shù)量的減少是一致的，提示腸上皮細(xì)胞來源的CXCL1增加可能是MDSCs數(shù)量增加的原因。隨后我們在體外證明，使用中和抗體封閉了上皮細(xì)胞來源的CXCL1后

7、，MDSCs的遷移減少;同時將IL-6和GM-CSF的中和抗體加入小鼠腸上皮來源的腫瘤細(xì)胞系CT26和MDSCs的共培養(yǎng)體系后，MDSCs的數(shù)量減少，證明腸上皮細(xì)胞來源的IL-6和GM-CSF促進(jìn)MDSCs的存活。
　　隨后我們用熒光定量PCR和免疫熒光檢測了WT和WSX-1 KO腫瘤建模小鼠的腸道緊密連接蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差異，并且血清中LPS也沒有明顯變化，證明促炎因子的變化不是由于局部來源于腸道菌群的病原相關(guān)模式

8、分子（Pathogen-associated Molecular Pattern，PAMPs）的數(shù)量變化導(dǎo)致的，而可能直接由腸上皮細(xì)胞的反應(yīng)性變化引起。因此我們進(jìn)一步用LPS和IL-27在體外刺激了原代腸上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-27可抑制LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞中促炎因子和趨化因子的分泌。最后，我們用抗生素組合喂食小鼠，清除腸道內(nèi)微生物來源的PAMPs后，再用AOM/DSS誘導(dǎo)腫瘤模型，我們發(fā)現(xiàn)在清除了微生物來源的PAMPs后，WT和WSX-

9、1 KO模型小鼠腸道腫瘤、腸道固有層MDSCs數(shù)量、腸上皮細(xì)胞促炎因子和趨化因子的表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)差異，證明IL-27對腸炎相關(guān)腸癌的保護(hù)作用是依賴PAMPs的。
　　綜上，本部分研究證明在慢性腸炎相關(guān)的腸癌模型發(fā)病過程中，IL-27可以抑制PAMPs觸發(fā)的腸上皮細(xì)胞中促炎因子和趨化因子的表達(dá)，從而降低了促腫瘤的髓系來源抑制細(xì)胞(MDSCs)的聚集，因此對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到抑制作用。本研究為闡明腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子的調(diào)控作用增添了新

10、的理論依據(jù)，也可能為腸癌的免疫治療提供新的思路。
　　第二部分白細(xì)胞介素-27受體敲除促進(jìn)小鼠肥胖及其機(jī)制的初步研究
　　肥胖是現(xiàn)代社會危害人類健康的隱形殺手之一，它所引發(fā)的代謝病癥長久以來困擾著人們的身體健康。我們對脂肪功能的認(rèn)識，也逐漸從簡單存儲能量，到作為內(nèi)分泌系統(tǒng)的一部分調(diào)節(jié)人體代謝功能。內(nèi)臟脂肪的含量和狀態(tài)，對健康有著非常重要的影響。隨著研究的深入，肥胖被認(rèn)為是一種慢性炎癥狀態(tài)，脂肪組織，特別是內(nèi)臟脂肪組織（vis

11、ceral adipose tissue，VAT）分泌的各種促炎因子如IL-6、TNF-α和C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）等在肥胖狀態(tài)下均表達(dá)上升，導(dǎo)致胰島素抵抗等相關(guān)表現(xiàn)。近年來發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟脂肪組織中存在一種特殊的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，脂肪Treg通過分泌IL-10和TGF-β對脂肪代謝的穩(wěn)態(tài)起到重要調(diào)節(jié)作用。正常狀態(tài)Treg細(xì)胞在脂肪中聚集，VAT Treg占CD4+T細(xì)胞的比例高于其他淋巴器官和非淋

12、巴器官，而在肥胖狀態(tài)下，Treg細(xì)胞比例在脂肪組織中急劇下降。
　　在進(jìn)行第一部分實(shí)驗(yàn)的時候，我們發(fā)現(xiàn)在較大年齡（24周以上）的小鼠中，WSX-1 KO小鼠體重略高于WT小鼠，同時查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)以往并沒有IL-27在肥胖中的作用研究，因此進(jìn)行了第二部分實(shí)驗(yàn)。
　　WSX-1 KO和WT小鼠給予正常飲食飼養(yǎng)在同樣環(huán)境下24周后，我們首先檢測其體重變化，發(fā)現(xiàn)WSX-1 KO小鼠體重相較于WT小鼠有明顯增加，并且內(nèi)臟脂肪的重量也有明

13、顯上升，流式檢測結(jié)果表明WSX-1 KO小鼠中VAT Treg數(shù)量下降。這些結(jié)果提示了IL-27受體敲除可促進(jìn)小鼠肥胖。隨后，我們進(jìn)一步用高脂飼料誘導(dǎo)肥胖模型，得到同樣結(jié)果。在喂養(yǎng)過程中，雖然兩組進(jìn)食量并沒有差距，但是WSX-1 KO小鼠的體重高于WT小鼠，核磁共振結(jié)果顯示其體脂含量也高于WT小鼠，并且WSX-1 KO小鼠中VATTreg數(shù)量也顯著降低，VAT Treg的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和PPAR-γ mRNA水平在內(nèi)臟脂肪中的含

14、量也顯著下降，這些結(jié)果進(jìn)一步證明，在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖模型中，IL-27/WSX-1信號也可以對肥胖發(fā)揮抑制作用。為了解這種現(xiàn)象是否具有臨床相關(guān)性，我們進(jìn)一步用ELISA檢測了肥胖患兒血漿中的IL-27含量，但有趣的是，發(fā)現(xiàn)跟對照組相比，肥胖兒童血漿中IL-27含量升高，我們推測IL-27可能是以一種代償效應(yīng)發(fā)揮作用，在肥胖狀態(tài)下應(yīng)激分泌。具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。
　　綜上所述，本部分研究我們初步發(fā)現(xiàn)了IL-27/WSX-