N6-甲基嘌呤(m6A)甲基轉移酶METTL14對胰腺癌增殖和侵襲轉移的影響及其機制研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分進行探討：
　　第一部分 N6-甲基嘌呤(m6A)在胰腺癌細胞系及組織中表達水平的檢測
　　目的：檢測m6A在胰腺癌癌組織及癌旁組織中的含量，比較胰腺癌癌組織和癌旁組織中mA6表達豐度的差異。
　　方法：采用比色法定量檢測了21例胰腺癌癌組織及相應癌旁組織，6種胰腺癌細胞系和8例正常胰腺組織中m6A的在總RNA中的表達水平，分析m6A在胰腺癌組織和癌旁組織的表達差異。采用液相色譜法定量檢測了21胰腺

2、癌癌組織及相應癌旁組織，7種胰腺癌細胞系和正常胰腺導管上皮細胞中m6A的在mRNA中的表達水平，分析m6A在胰腺癌組織和癌旁組織的表達差異。
　　結果：與正常胰腺組織和人正常胰腺導管上皮細胞相比，胰腺癌癌組織和細胞系中的m6A是高表達的。
　　結論：m6A在胰腺癌中表達豐度是增加的
　　第二部分 N6-甲基嘌呤(m6A)甲基轉移酶METTL14在胰腺癌組織中的表達與預后
　　目的：檢測METTL14在120例胰腺

3、癌病人在胰腺癌中的表達，并結合病人的臨床資料，研究 METTL14在胰腺癌組織及相應癌旁組織中的表達差異，探討METTL14表達水平與患者臨床資料的相關性。
　　方法：檢測METTL14在120例胰腺癌患者的在癌組織和相應癌旁組織中的表達水平，并結合病人的臨床資料，分析METTL14的表達量與胰腺癌病人臨床分期、病理分級、淋巴結轉移和預后的關系。然后，采用real-time PCR和western blot的方法對我院膽胰外科20

4、例胰腺癌組織標本進一步檢測和確認METTL14的表達水平。
　　結果：1.與癌旁組織相比較，METTL14在胰腺癌組織中主要呈高表達，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。結合臨床病理資料分析顯示，METTL14的表達與胰腺癌病人的淋巴結轉移相關（P<0.05）。結合隨訪資料的生存分析顯示，METTL14的高表達與胰腺癌病人的預后較差（P<0.05）。
　　2.胰腺癌組織中METTL14基因水平較相應癌旁組織增加。
　

5、　3.胰腺癌組織中METTL14蛋白水平較相應癌旁組織增加（P<0.05）。
　　結論：METTL14在胰腺癌組織多呈高表達，高表達的METTL14胰腺癌病人的淋巴結轉移相關，且提示胰腺癌病人較差的預后。
　　第三部分 METTL14對胰腺癌增殖和侵襲轉移影響的體內外研究
　　目的：本部分使用3種胰腺癌細胞系作為工具，通過構建METTL14下調或過表達的穩(wěn)轉細胞系，研究METTL14干預對胰腺癌細胞增殖和侵襲轉移能力的

6、影響。
　　方法：利用慢病毒載體has-METTL14-SH-flag和has-METTL14-flag轉染轉染人胰腺癌細胞Panc-1、Mia和Bxpc-3后，構建METTL14下調干預或上調干預的穩(wěn)轉細胞系。檢測METTL14干預后m6A的變化。通過CCK8、平板克隆實驗、transwell和劃痕實驗，分析METTL14干預后胰腺癌細胞增殖和侵襲轉移能力的變化。使用上調和下調METTL14的穩(wěn)轉PANC-1細胞系，構建裸鼠皮下

7、成瘤模型和裸鼠胰腺癌細胞脾臟包膜注射肝轉移模型，評價METTL14干預后胰腺癌細胞系在裸鼠體內成瘤能力和侵襲轉移能力的差異。
　　結果：1.甲基化酶METTL14可以調控胰腺癌細胞中m6A水平的變化。
　　2.在3種胰腺癌細胞系中下調METTL14，可以顯著降低胰腺癌細胞的增殖和侵襲轉移的能力。
　　3.在胰腺癌細胞系中上調METTL14，可以顯著增加胰腺癌細胞的增殖和侵襲轉移的能力。
　　4.裸鼠皮下成瘤模型中

8、，下調 METTL14表達可以減少皮下成瘤的體積，上調METTL14表達可以增加皮下成瘤的體積相對于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義。
　　5.上調METTL14的表達，可以促進裸鼠脾包膜注射肝轉移模型中肝臟微轉移灶的形成，下調METTL14的表達，可以抑制裸鼠脾包膜注射肝轉移模型中肝臟微轉移灶的形成。和對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論：METTL14可以調控胰腺癌細胞的m6A的變化，METTL14促進胰腺癌細胞的增殖

9、和侵襲轉移。
　　第四部分 METTL14促進胰腺癌增殖和侵襲轉移的分子機制研究
　　目的：研究METTL14通過作用于哪條可能的信號通路調控胰腺癌的惡性生物學行為。
　　方法：利用二代測序技術篩選METTL14敲減干預后發(fā)生變化的信號通路及差異的miR表達譜，再結合生物信息學的方法，預測調控信號通路的microRNA，篩選出METTL14調控的信號通路所依賴的microRNA。
　　結果：1. METTL14對