褶紋冠蚌1-Cys和2-Cys型過氧化物還原酶基因的分子克隆及表達.pdf

1、學位論文獨創(chuàng)性聲明學位論文獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得直昌太堂或其他教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我二垌工作的同志對本研究所做的任何一0，貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名(手寫)：彩艄毛南峰字日期：≯卅，，年多月frj’日學位論文版權使用授權書

2、本學位論文作者完全了解直昌太堂有關保留、使用學位論文的規(guī)定，有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權直昌太堂可以將學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編本學位論文。同時授權中國科學技術信息研究所和中國學術期刊(光盤版)電子雜志社將本學位論文收錄到《中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫》和《中國優(yōu)秀博碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫》中全文發(fā)表，并通過網絡向社會公眾

3、提供信息服務。(保密的學位論文在解密后適用本授權書)學位論文作者簽名(手寫)：餮嗚袒導師簽名(手寫)：匆銥簽字日期多_，，年∥月u一日簽字日期：抄f／，年∥月肛啊墊堊㈣炒嬲___________。_____________________‘‘。__I‘。?！瘛！?。。?！痮‘。。。。。’’。。。‘。‘。。?！?。‘o‘’‘‘。?！?。?！?。。o。‘。H■■一一一摘要褶紋冠蚌(Cristariaplicata)是我國主要的淡水育珠

4、蚌之一，隨著集約化養(yǎng)殖的發(fā)展和環(huán)境惡化，由病原體，化學物質引起的各種疾病頻繁發(fā)生于褶紋冠蚌的養(yǎng)殖群體中。過氧化物還原酶(Peroxiredoxin)是一個新發(fā)現(xiàn)的抗氧化酶家族，能夠維持細胞內的氧化還原平衡通過消除細胞內的過氧化氫和烷基過氧化氫。本對褶紋冠蚌的1CysPrx和2Cys型Prx基因進行研究，以期闡明這兩類抗氧化蛋白在褶紋冠蚌免疫統(tǒng)中的作用機制，為蚌類抗病機理研究提供理論依據(jù)。1褶紋冠蚌!Cys過氧化物還原酶的克隆及表達研究一

5、，‘褶紋冠蚌Prx6(CpPrx6)基因的cDNA序列全長1617bp；其中5’端不翻譯區(qū)為71bp，3’端不翻譯區(qū)為889bp，開放閱讀框為657bp，可以編碼218個氨基酸。CpPrx6的預測分子量為2424kDa，理論等電點為633。同源性分析顯示CpPrx6含有1CysPrx共有的保守GPX催化中心“PVCTTE“和脂肪酶基序“GKSW”。CpPrx6二級結構包含6個q螺旋、12個p折疊。經序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明褶紋冠蚌與

6、南極帽貝(Hyriopsiscumingii)、太平洋牡蠣(Crassostreagigas)、皺紋盤鮑(Haliotisdiscusdiscus)的1Cys過氧化物還原酶基因具有非常高的同源性。RTPCR檢測顯示，CpPrx6基因在血細胞、外套膜、閉殼肌、肝臟、鰓等組織中均有表達，其中以鰓組織表達最強，顯著高于其他組織。嗜水氣單胞茵刺激后在肝臟中12h內CpPrx6基因的表達量不斷上升，24h時恢復到正常水平。在刺激后6h時，實驗組和

7、對照組之間具有顯著性差異。12h時達到極顯著。將CpPrx6進行體外重組并在大腸桿菌EcoliBL21(DE3)中實現(xiàn)表達。利用SDSPAGE分析表達產物，發(fā)現(xiàn)經IPTG誘導的實驗組較空白對照菌在40KDa處增加了一條明顯的蛋白條帶。說明CpPrx6基因在PET原核表達系統(tǒng)能夠得到表達。2褶紋冠蚌2Cys過氧化物還原酶的克隆及表達研究褶紋冠蚌TP)【基因的eDNA序列全長1247bp：其中5’端UTR為90bp，3’端UTR為566bp

8、，開放閱讀框(OpenReadingFrame，ORF)591bp，可以編碼196個氨基酸。CpTPx含有2CysPrx都含有含有保守Fmotif“FTFVCPTEI“和高度保守的輸水區(qū)域“VCPAGW“，并且也含有真核生物典型2CysPrx的特征序列“GGLG’’，由此可以得出結論：CpTPx屬于典型2CysPrx。CpTPx二級結構包含5個a螺旋、7個p折疊，間隔有2段無規(guī)則卷曲。系統(tǒng)進化樹顯示，褶紋冠蚌TPx與其他物種的Prxl聚