整合子介導(dǎo)銅綠假單胞菌獲得性耐藥機制的研究.pdf

1、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)屬于非發(fā)酵菌屬，廣泛的分布于自然界及醫(yī)療環(huán)境中，是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要條件致病菌。β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類及氨基糖苷類藥物是臨床常規(guī)治療PA感染的關(guān)鍵藥物，然而隨著藥物的廣泛使用，PA逐漸獲得了對上述藥物的耐藥性，進而演化成多重耐藥及泛耐藥菌株，造成臨床抗感染治療的失敗，嚴重的威脅人類的健康。PA耐藥演變機制較為復(fù)雜，可以通過多種方式取得對抗菌藥物的耐藥。首先，PA可以借助其

2、低滲透能力的外膜蛋白、染色體編碼的AmpC酶以及主動外排系統(tǒng)的作用而天然表現(xiàn)對某些種類的抗菌藥物耐藥;其次，PA在天然耐藥的基礎(chǔ)上不斷通過自身基因組突變而達到對抗菌藥物的適應(yīng)性耐藥;最后，PA可以通過一些耐藥基因水平轉(zhuǎn)移元件的參與直接獲取外界耐藥基因，迅速演化成耐藥菌株，進一步造成耐藥范圍的擴大及耐藥菌株的廣泛傳播。然而以上幾點因素并非孤立存在，而是相互作用共同導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生。因此研究PA耐藥演變機制，研究耐藥傳播動力，對于采取恰當(dāng)

3、的應(yīng)對措施，延緩耐藥菌株的產(chǎn)生具有積極的意義。本研究擬在前期臨床分離PA菌株耐藥表型監(jiān)測的基礎(chǔ)上，開展獲得性耐藥分子機制的研究，以期通過耐藥表型結(jié)合耐藥分子來闡明地區(qū)間PA耐藥演變規(guī)律，為耐藥菌株臨床治療及控制提供合理的理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.收集并保存煙臺、合肥及鎮(zhèn)江地區(qū)3所醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)PA菌株260株;菌株的鑒定采用法國梅里埃公司全自動微生物分析儀或API鑒定系統(tǒng);藥物敏感試驗采用K-B紙片法;藥

4、物敏感結(jié)果統(tǒng)計分析采用WHONET5.0軟件;整合子檢測采用PCR方法。
　　 2.IntI基因檢測陽性菌株進一步采用PCR方法擴增可變區(qū)，可變區(qū)PCR結(jié)果一致性條帶采用PCR-RFLP(Restrictionfragmentslengthpolymorphism)分析以確定可變區(qū)類型;ISCR1基因及其可變區(qū)的檢測采用PCR方法，并采用PCR-RFLP分析來確定ISCR1基因可變區(qū)類型;復(fù)合型整合子檢測采用PCRmapping

5、方法。對PCR產(chǎn)物進行純化及回收，送上海英駿生物公司行雙向測序，部分PCR產(chǎn)物克隆至pTG-18T質(zhì)粒進行測序。測序結(jié)果進行拼接，拼接結(jié)果采用在線BLAST比對分析來確定基因組結(jié)構(gòu)。提取質(zhì)粒，采用電化至受體菌，通過PCR驗證整合子的可轉(zhuǎn)移性。
　　 3.對新的p一內(nèi)酰胺基因變異體blaOXA-251，應(yīng)用DNAstar、clustal1.8及mega4.0軟件對其核苷酸及蛋白質(zhì)序列進行生物信息學(xué)研究，構(gòu)建進化樹分析。將全編碼bl

6、aOXA-10、blaOXA-251基因克隆至pET-28a表達載體，轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21，采用抗性平板進行轉(zhuǎn)化株的篩選。采用瓊脂稀釋方法檢測野生株及轉(zhuǎn)化子對不同種類藥物MIC。采用超聲波粉碎方法進行粗酶的提取，并通過等電點聚焦電泳檢測等電點。
　　 結(jié)果:
　　 1.本次耐藥監(jiān)測的臨床菌株主要來自住院患者的痰標(biāo)本(75％)，科室分布主要集中在ICU(25.4％)、呼吸內(nèi)科(24.2％)及神經(jīng)內(nèi)科(11.5％)等科室。耐

7、藥檢測結(jié)果顯示，PA菌株對CTX和SXT耐藥率高(＞60％)，對IPM和AK耐藥率低(＜20％)，對PB完全敏感，對其它種類抗菌藥物的耐藥率由低到高依次為:FEP(20.30％)、TZP(21.5％)、CA2(22.6％)、ATM(31.9％)、TOB(31.9％)、CFP(38.1％)、GEN(38.8％)、PRL(41.9％)歿CIP(49.2％)。檢測123株多重耐藥菌株(47％)，其中對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類及喹諾酮類呈多重耐

8、藥菌株89株(34.2％);檢出Ⅰ類整合子陽性菌株109株(41.9％)，Ⅱ類整合子4株(1.5％)，未檢測出Ⅲ類整合子。發(fā)現(xiàn)除PB藥物外，Ⅰ類整合子檢測陽性菌株對不同種類抗菌藥物耐藥率顯著高于Ⅰ類整合子檢測陰性菌株(P＜0.01)，此外Ⅰ類整合子檢測陽性菌株的多重耐藥率也顯著高于Ⅰ類整合子檢測陰性菌株(X2=5.26，P＜0.01)。
　　 2.109株intI1基因陽性PA菌株有95株有效的擴增出Ⅰ類整合子可變區(qū)，其中其中有

9、9株為空整合子類型，有3株為非特異性擴增。發(fā)現(xiàn)13種耐藥基因盒，分別包括氨基糖苷類類耐藥基因（aadA1、aadA2、aadA3、aadA3C、aacA7、aadA13、aadB）、磺胺類耐藥基因（dfrA12）、氯霉素耐藥基因(cmlA8)以及β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（blaP1、blaOXA-251、blaOXA-10、blaIMP-4）。發(fā)現(xiàn)兩個新的耐藥基因盒:aadA3C和blaOXA-251。aadA3C與aacA3(GenBan

10、k:M29695)存在3個核苷酸位點突變，其中兩個為無義突變，有一個導(dǎo)致編碼氨基酸的突變(Asp85Gly);blaOXA-251基與其最近的匹配序列blaOXA-10存在3個核苷酸的突變，分別導(dǎo)致其編碼氨基酸的改變:Gly128Asp，Lys137Asn、Ile187。blaOXA-251基因序列遞交http://www.lahey.org/Studies網(wǎng)站，獲取新的OXA酶編號:OXA-251。發(fā)現(xiàn)由耐藥基因盒排列組成7種類型整合

11、子排列方式，依據(jù)片段結(jié)構(gòu)大小分別為:blaP1、aacA7、aadB-aadA1、blaVIM4-blaP1、drfA12-orfaadA2、aacA3C-aadA13-blaOXA-251、aacA3-aadA13-clmA8-blaOXA-10。在PA菌株中發(fā)現(xiàn)aadB-aadA1和aacA3C-aadA13-blaOXA-251兩種新的整合子，獲取GenBank號分別為JN157817、JN118546，其中aacA3C-aadA

12、13-blaOXA-251為一種從未報道的整合子類型，被http://integrall.bio.ua.pt網(wǎng)站命名編號為In713。發(fā)現(xiàn)4株Ⅱ類整合子攜帶同一種耐藥基因盒組合，為dfrAl-satl-aadA1;發(fā)現(xiàn)PA菌株同時攜帶Ⅰ、Ⅱ型整合子，共存方式為blaPl和dfrAl-satl-aadA1。檢測出15株ISCR1基因陽性菌株，PCR-RFLP顯示其為同一種類型，序列分析發(fā)現(xiàn)其攜帶blaPER-1、ABCtransporte

13、r，gst、qacEA基因采用PCRmapping方法檢測出3種類型復(fù)合性整合子結(jié)構(gòu):intll-aacA7-qacE⊿-sul-ISCRl-blaPER-1-gst-ABCtransporter-qacEA,intIl-aacA3C-aadA13-blaOXA25,-ISCRl-blaPER-1-gst-ABCtransporter-qacE⊿和intl-aacA3-aadA13-clmA8-blaOXA-10-ISCRl-blaPE

14、R-1-gst-ABCtransporter-qacE⊿.采用電轉(zhuǎn)化的方式成功的將含blaP1及drfA12-orfaadA2整合子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)的大腸桿菌。
　　 3.PCR獲取blaOXA一251基因全長804bp，編碼266個氨基酸序列。生物信息學(xué)分析顯示其來自O(shè)XA-10酶的突變。成功的構(gòu)建含blaOXA-10、blaOXA-251轉(zhuǎn)化子，并測其等電點分別為7.1及7.5。藥敏結(jié)果顯示，含blaOXA-251轉(zhuǎn)化子對P

15、RL、CTX、ATM、CAZ、CFP、FEP、FOX藥物的MIC明顯高于blaOXA-10轉(zhuǎn)化子菌株，其中對PRL，CTX、ATM處于耐藥范圍，但是對IPM及MEM未發(fā)現(xiàn)變化。
　　 結(jié)論:
　　 1.在臨床PA菌株中，Ⅰ類整合子最為普遍，且與菌株的耐藥及多重耐藥密切相關(guān);Ⅱ類整合子比較少見，未發(fā)現(xiàn)Ⅲ類整合子。
　　 2.PA菌株可以通過整合子介導(dǎo)對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氯霉素類及甲氧芐啶耐藥，并且耐藥性可以

16、通過質(zhì)粒在菌株之間水平傳播。
　　 3.首次在PA中發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因盒aacA3C和blaOXA-251及新的整合子aadB-aadA1和aacA3C-aadA13-blaOXA-251。這一結(jié)果表明，整合子可以借助其自身基因組結(jié)構(gòu)的多樣性和靈活性的優(yōu)勢不斷的適應(yīng)外界環(huán)境。
　　 4.在PA菌株中發(fā)現(xiàn)由ISCR1基因元件組成復(fù)合型整合子結(jié)構(gòu)，并闡明其在PA耐藥形成中的作用。
　　 5.成功的克隆并表達了blaOX