核型多角體病毒Bm25，Bm46，Ha127基因特性的初步研究.pdf

1、桿狀病毒(Baculovirus)是節(jié)肢動(dòng)物，特別是鱗翅目昆蟲(chóng)重要的病原微生物，桿狀病毒的分子生物學(xué)研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展。到目前為止，已有29種桿狀病毒，包括22種核型多角體病毒和7種顆粒體病毒的基因組全序列被測(cè)定。部分基因功能至今沒(méi)有研究報(bào)道，本論文選擇了家蠶核型多角體病毒(Bombyxmori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)off25、orf筘和棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒(Helicoverp8 armigera

2、 single nucleopolyhedrovirusvirus，HaSNPV)orf127三個(gè)功能未知的基因?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平進(jìn)行了初步的分析，從而為豐富桿狀病毒分子生物學(xué)提供理論知識(shí)。本論文的主要結(jié)論如下： 1.Bin25基因的分析 Bm25基因位于BmNPV(T3株)基因組24367-25014nt，全長(zhǎng)648bp，編碼一個(gè)含215個(gè)氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測(cè)分子量約為24.8kDa，在Bin25基因

3、起始密碼子ATG上游146nt處有桿狀病毒晚期轉(zhuǎn)錄基序ATAAG。轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)Bm25在病毒感染宿主細(xì)胞18h．p.i.開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，并一直持續(xù)到72h．p.i.。用PCR方法擴(kuò)增了Bm25基因，在大腸桿菌中進(jìn)行了融合表達(dá)，并制備了多克隆抗血清。利用該抗血清Western blot分析，發(fā)現(xiàn)在病毒感染宿主細(xì)胞后24h一直到72 h檢測(cè)到Bm25基因表達(dá)產(chǎn)物。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明Bm25是一個(gè)晚期表達(dá)基因。 利用BmNPV Bacmid表達(dá)系

4、統(tǒng)，在家蠶細(xì)胞和幼蟲(chóng)中對(duì)C端融合有EGFP的Bm25進(jìn)行了共表達(dá)。感染后3天熒光顯微鏡下觀察到強(qiáng)烈的綠色熒光，但是SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)融合蛋白的大小明顯小于預(yù)測(cè)的50 kDa。此結(jié)果的產(chǎn)生可能與細(xì)胞，幼蟲(chóng)組織中或病毒本身的蛋白酶的降解有關(guān)。 2.Bm46基因的分析 Bm46基因位于BmNPV(T3株)基因組42221-42706nt，全長(zhǎng)486bp，編碼一個(gè)含161個(gè)氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測(cè)分子量約為19.1kDa，在Bm

5、46基因起始密碼子ATG上游162nt處有桿狀病毒早期轉(zhuǎn)錄基序CAGT，127nt處有桿狀病毒晚期轉(zhuǎn)錄基序TTAAG。對(duì)Bm46基因的RT-PCR分析表明，Bm46轉(zhuǎn)錄起始于病毒感染后3h，并一直持續(xù)到感染晚期。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了Bm46融合蛋白并制備了多克隆抗體。通過(guò)Western blot分析了Bm46蛋白的表達(dá)時(shí)相，在感染后6 h檢測(cè)到24kDa的基因產(chǎn)物。因此從Bm46的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)時(shí)相可以得出該基因是一早期表達(dá)蛋白。利用

6、Bac-to-Bac系統(tǒng)，在家蠶細(xì)胞和蛹中共表達(dá)了Bm46-EGFP融合蛋白。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)該融合蛋白的大小小于理論值，推測(cè)是水解性的蛋白酶降解所致。 3.Ha127基因的分析 Ha127基因位于HaSNPV-C1基因組119723-120301nt，全長(zhǎng)579bp，編碼一個(gè)含192個(gè)氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測(cè)分子量約為22.6kDa。在Ha127基因起始密碼子ATG上游200nt內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)桿狀病毒早期轉(zhuǎn)錄基序CA

7、GI、和晚期轉(zhuǎn)錄基序TAAG，該基因的5’Race結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于基因起始密碼子ATG上游188nt。對(duì)Ha127基因的RT-PCR分析表明，Ha127基因轉(zhuǎn)錄開(kāi)始于病毒感染后18 h，并在72 h．p.i.還能檢測(cè)到該基因的轉(zhuǎn)錄。利用多克隆抗體對(duì)病毒感染的細(xì)胞進(jìn)行雜交分析，結(jié)果顯示：分子量為30kDa的Ha127蛋白出現(xiàn)在感染后24 h，并一直持續(xù)到72 h．p.i.。以上結(jié)論說(shuō)明Ha127在病毒感染后晚期表達(dá)。利用Ha127