基于LDR對高度降解和微量DNA檢材的SNPs分型研究.pdf

1、中國醫(yī)科大學博士學位論文基于LDR對高度降解和微量DNA檢材的SNPs分型研究姓名：張振申請學位級別：博士專業(yè)：法醫(yī)學指導教師：王保捷20080301影子帶(stutter帶)、等位基因丟失等一些難以避免的問題，STR分型結果通常具有不可重復性，并難以評價其有效性，無法得到可靠的法醫(yī)學鑒定結論。近年來，基于連接酶檢測反應(LDR)的SNPs分型技術快速發(fā)展，為降解檢材和微量檢材的法醫(yī)學DNA分析提供了新的契機。首先，LDR探針與模板DN

2、A互補結合的序列不需過長，只要滿足以下兩個條件即可：(1)能夠有效識別待測靶位點，(2)不影響連接酶的識別與結合所需片段長度，所以，LDR探針長度不超過數(shù)十個堿基。再者，對于雙鏈DNA的單鏈切口，DNA連接酶的識別與連接反應具有高度嚴謹性。因此，從理論上說，只要DNA片段不小于30“50bp，即可采用LDR技術進行SNP分型檢測，這一特性尤其適用于高度降解DNA分析。所以，本文嘗試LDRPCR策略來檢測高度降解DNA。再者，鎖式探針(p

3、adlockprobes)可識別靶位點并形成包含單鏈切E1的局部雙螺旋結構，經LDR反應可生成環(huán)狀模板，LDR反應的高度嚴謹性保證了等位基因識別的準確性；同時，超分支滾環(huán)擴增反應具有極強的擴增效能，可極大地放大LDR檢測信號。將二者結合起來，對LCN檢材的分析效能將得以極大提高。所以，本文擬丌發(fā)LDRHRCA策略來檢測LCN檢材。材料與方法枸櫞酸鈉抗凝人未梢靜脈血樣品12份，男女各6份，由中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院法醫(yī)血清學教研室提供。采用酚

4、一氯仿法提取基因組DNA。分別使用超聲法和DNaseI酶切法處理高分子量基因組DNA，于不同時間段取樣，電泳和／或PCR擴增檢測DNA片段長度，人工制備不超過lOObp的高度降解DNA檢材。使用AmpFlSTR@ldentifiler@PCRAmplificationKit對降解DNA檢材進行復合STR分型檢驗。選擇4個待測SNPs位點(rsl7750303、rs2307647、rs2307557和rsl7250992)，并構建各位點的