Oct4在非小細胞肺癌中的表達及對吉非替尼耐藥性的影響.pdf

1、背景：
　　肺癌是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤，占惡性腫瘤死亡原因的第一位。目前，我國每年新發(fā)肺癌約50萬，到2025年預計每年將有100萬新發(fā)肺癌患者，近30年來，我國肺癌死亡率上升了465％，嚴重威脅著人民群眾的健康和生命。非小細胞肺癌(non-smallcell lung cancer, NSCLC)是肺癌的主要病理類型，約占肺癌的85％～90％。與小細胞肺癌相比，NSCLC的生長較為緩慢，轉移較晚，但診斷時可手術切除的病例僅占

2、15～18％，術后發(fā)生轉移或復發(fā)的機率很高，以順鉑為基礎的雙藥聯合化療的緩解率僅30％左右，化療在改善晚期NSCLC患者的生存期方面的作用十分有限。因此整體而言，NSCLC病人的預后不佳。隨著對肺癌分子分型的研究進展，NSCLC的治療已邁入精準醫(yī)療時代，表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）是其中研究最廣泛并已廣泛應用到臨床的靶向基因之一。在NSCLC患者中，EGFR突變主要發(fā)生

3、在胞內段編碼結構域（外顯子18-21），包括外顯子19的缺失突變(delE746-A750)和外顯子21的點突變(L858R)，這些突變使NSCLC對表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(epithelial growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)的敏感性增加，稱作增敏EGFR突變，占所有EGFR突變的90％以上，高達50％的亞洲NSCLC患者中發(fā)現這些增敏EG

4、FR突變。EGFR-TKI使晚期NSCLC的治療從標準含鉑雙藥的化療時代進入靶向治療時代，以吉非替尼和厄洛替尼為代表的第一代EGFR-TKI已成為EGFR敏感突變陽性患者的一線首選治療藥物。多個大規(guī)模的臨床試驗已證明EGFR敏感突變陽性患者可從EGFR-TKI一線治療中獲益，然而耐藥問題始終如影隨形，多數存在增敏EGFR突變的NSCLC患者在約8～16個月治療后對吉非替尼產生耐藥性，對于EGFR-TKI耐藥機制的探索已成為國內外研究的熱

5、點。NSCLC對EGFR-TKI的分子耐藥機制包括EGFR20外顯子T790M突變、MET基因擴增、上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、向小細胞肺癌轉化和EGFR通路的旁路激活等，其中以20外顯子T790M突變最為常見。
　　肺癌耐藥的另一種機制是獲得腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSC)表型，通過多能性轉錄因子（如Oct4，Sox2和Nanog）的表達介導。

6、CSC，又稱腫瘤干細胞、癌干細胞，是指具有干細胞特性的小部分癌細胞，即具有“自我復制”以及“多向分化”能力的癌細胞。CSC被認為是腫瘤克隆的發(fā)生核心，代表驅動腫瘤生長和進展的細胞群體，它是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉移和耐藥復發(fā)的根源。多項研究表明肺癌中具有高致瘤性、多潛能、可自我更新、高耐藥的CSC的存在。八聚體結合轉錄因子4(octamer-binding transcription factor4，Oct4)是胚胎干細胞維持自我更新及分

7、化潛能的最重要的轉錄因子，也是胚胎干細胞的標志物。Oct4在人體多種實體腫瘤中呈過表達，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，復發(fā)和轉移。Oct4高表達患者的疾病進展快、易轉移并預后差。使用人非小細胞肺腺癌細胞系和患者的原發(fā)性肺癌細胞發(fā)現，盡管CSC有不同的表型，但其均表達多潛能干細胞基因，尤其是Oct4，Sox2和Nanog，可以作為CSC的標志物。Oct4與腫瘤干細胞的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)表型相關，在惡性腫

8、瘤化療耐藥的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，這使Oct4可能成為癌癥治療的重要靶標，特別是針對具有化療抗性的腫瘤類型，然而，很少有研究涉及Oct4在腫瘤靶向藥物的耐藥過程中所起的作用。有研究發(fā)現，轉基因CCSP-rtTA/TetO-EGFR(L858R/T790M)誘導EGFR突變吉非替尼耐藥的小鼠肺組織中Oct4和Sox2表達增加。然而，調節(jié)CSC在吉非替尼耐藥性中的分子機制尚未完全澄清。信號傳導及轉錄激活子3(signal trans

9、ducer and ac-tivatorof transcription3，STAT3)是高度保守的轉錄因子家族成員之一，正常情況下參與細胞周期和細胞凋亡的調控，在惡性腫瘤中也與腫瘤的侵襲轉移、腫瘤血管的發(fā)生及腫瘤細胞的免疫逃逸等有關，并通過調節(jié)干細胞相關轉錄因子的表達參與維持干細胞表型和多能性。Survivin是凋亡抑制蛋白家族中的重要成員，survivin基因啟動子上含有STAT3的結合位點。STAT3途徑也參與肺癌的發(fā)生，STAT

10、3的激活是NSCLC對EGFR-TKI耐藥的內在機制，Oct4是否在STAT3/survivin信號途徑中發(fā)揮作用尚少研究。對Oct4在NSCLC中的表達及其對吉非替尼耐藥性影響的相關機制進行研究能夠更好的闡明肺癌耐藥的發(fā)生和發(fā)展機制，從而采取針對性的治療策略以期進一步提高EGFR突變肺癌患者的靶向藥物治療的有效率和持久性。
　　目的：
　　探討Oct4 mRNA和蛋白在NSCLC患者腫瘤組織的表達及其與患者臨床病理特征的相

11、關性，應用Oct4-siRNA轉染構建特異性沉默Oct4基因表達的PC-9和PC-9/GR細胞系，探討Oct4在NSCLC中對腫瘤細胞增殖和吉非替尼獲得性耐藥的作用及其可能的信號通路。
　　方法：
　　(1)Oct4在非小細胞肺癌組織中的表達及意義
　　86例NSCLC患者肺癌組織樣本（NSCLC組）及其相應癌旁正常組織樣本（對照組）。采用熒光定量PCR法、免疫組化法以及western blot法分別檢測上述組織樣本中

12、Oct4 mRNA和蛋白的表達，分析其表達與患者臨床病理特征包括年齡、性別、吸煙指數、腫塊大小、分化程度、TNM分期及病理類型等的相關性。
　　(2)Oct4在非小細胞肺癌增殖及對吉非替尼耐藥中的作用
　　選擇含有EGFR外顯子19缺失突變的人肺癌細胞系PC-9及吉非替尼獲得性耐藥的細胞系PC-9/GR作為研究對象，采用熒光定量PCR法和westernblot法分別檢測PC-9細胞和PC-9/GR細胞中Oct4 mRNA和蛋

13、白的表達。應用Oct4-siRNA轉染構建特異性沉默Oct4基因表達的PC-9和PC-9/GR細胞系，分為四組:Con-siRNA PC-9細胞組（轉染Con-siRNA）、Oct4-siRNA PC-9細胞組（轉染Oct4-siRNA）、Con-siRNA PC-9/GR細胞組（轉染Con-siRNA）和Oct4-siRNA PC-9/GR細胞組（轉染Oct4-siRNA）。Western blot法檢測抑制Oct4基因表達后人肺癌P

14、C-9細胞和PC-9/GR細胞中Oct4蛋白的表達情況，MTT法檢測PC-9細胞和PC-9/GR細胞在轉染后24h、48h和72h時的增殖活性。然后將PC-9和PC-9/GR細胞各分為4組-Con-siRNA組（轉染Con-siRNA）、Con-siRNA+Gefitnib組（2.5μM吉非替尼+轉染Con-siRNA）、Oct4-siRNA組(轉染Oct4-siRNA)和Oct4-siRNA+Gefitnib組(2.5μM吉非替尼+轉

15、染Oct4-siRNA)，采用流式細胞術檢測上述各組細胞的凋亡率。
　　(3)OCT4對非小細胞肺癌吉非替尼耐藥的機制研究
　　Western blot法檢測PC-9細胞和PC-9/GR細胞中p-STAT3和survivin蛋白的表達，免疫熒光檢測Oct4和p-STAT3蛋白在PC-9細胞和PC-9/GR細胞的表達。應用Oct4-siRNA轉染構建特異性沉默Oct4基因表達的PC-9和PC-9/GR細胞系，分為四組:Con-

16、siRNA PC-9細胞組（轉染Con-siRNA）、Oct4-siRNA PC-9細胞組（轉染Oct4-siRNA）、Con-siRNA PC-9/GR細胞組(轉染Con-siRNA)和Oct4-siRNA PC-9/GR細胞組（轉染Oct4-siRNA），采用熒光定量PCR法及western blot法分別檢測上述四組Oct4，p-STAT3和survivinmRNA和蛋白的表達。
　　結果：
　　(1)Oct4在非小細

17、胞肺癌組織中的表達及意義
　　熒光定量PCR檢測結果表明，NSCLC組中Oct4 mRNA的表達量明顯高于對照組(t=3.566，P=0.008)。Western blot法檢測結果表明，NSCLC組中Oct4蛋白的表達量明顯高于對照組（t=3.764，P=0.007）。免疫組化檢測結果表明，Oct4蛋白染色陽性呈棕黃色顆粒狀;與對照組相比，NSCLC組Oct4蛋白的陽性細胞百分比明顯增高(t=8.033，P＜0.001)。Oct

18、4的表達在患者的性別、年齡、吸煙指數和腫塊大小等方面無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），而與患者的病理類型，分化程度和TNM分期有關，在腺癌、分化程度低和TNMⅢ期的患者中Oct4表達明顯增加(P＜0.05)。
　　(2)Oct4在非小細胞肺癌增殖及對吉非替尼耐藥中的作用
　　與PC-9細胞相比，PC-9/GR細胞中Oct4 mRNA（t=4.21，P=0.006）和Oct4蛋白（t=4.233，P=0.005）的表達量均明顯增高

19、。在PC-9細胞中，Oct4-siRNA組Oct4蛋白的表達量明顯低于Con-siRNA組(t=3.985，P=0.009)。在PC-9/GR細胞中，Oct4-siRNA組Oct4蛋白的表達量明顯低于Con-siRNA組（t=4.117，P=0.007）。在PC-9和PC-9/GR細胞中，轉染后24h、48h和72h時Oct4-siRNA組增殖活性均明顯低于Con-siRNA組（P＜0.05）。在PC-9細胞中，與Con-siRNA組相

20、比，Con-siRNA+Gefitnib組的細胞凋亡率明顯增高(X2=8.644，P=0.003);與Oct4-siRNA組相比，Oct4-siRNA+Gefitnib組的細胞凋亡率明顯增高(X2=9.019，P=0.002)。在PC-9/GR細胞中，與Con-siRNA組相比，Con-siRNA+Gefitnib組的細胞凋亡率無統(tǒng)計學差異(X2=1.413，P=0.872);與Oct4-siRNA組相比，Oct4-siRNA+Gefi

21、tnib組的細胞凋亡率明顯增高(X2=8.798，P=0.004)。
　　(3)OCT4對非小細胞肺癌吉非替尼耐藥的機制研究
　　與PC-9細胞相比，PC-9/GR細胞中磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白的表達量明顯增高(t=4.197，P=0.004);與PC-9細胞相比，PC-9/GR細胞中survivin蛋白的表達量明顯增高(t=3.639，P=0.008)。免疫熒光檢測結果表明，Oct4與p-STAT3蛋白在PC

22、-9細胞和PC-9/GR細胞均表達于細胞核，而兩者在PC-9/GR細胞中的表達水平較PC-9細胞明顯提高。熒光定量PCR檢測結果發(fā)現，在PC-9細胞， Oct4-siRNA組Oct4、p-STAT3和survivin mRNA的表達量與Con-siRNA組相比均明顯減少(t=2.934，3.024，3.216，P=0.037，0.031，0.025);在PC-9/GR細胞，Oct4-siRNA組Oct4、p-STAT3和survivin

23、mRNA的表達量與Con-siRNA組相比均明顯減少(t=3.108，2.014，2.572，P=0.009，0.028，0.017)。Western blot法檢測結果發(fā)現，在PC-9細胞，Oct4-siRNA組Oct4、p-STAT3和survivin蛋白的表達量與Con-siRNA組相比均明顯減少(t=2.889，2.985，2.917，P=0.018，0.007，0.013);在PC-9/GR細胞，Oct4-siRNA組Oct4

24、、p-STAT3和survivin蛋白的表達量與Con-siRNA組相比均明顯減少（t=3.737，3.756，3.011， P=0.002，0.002，0.007）。
　　結論：
　　(1)Oct4在NSCLC組織中的表達增加;Oct4高表達與NSCLC的低分化、TNM分期高及病理分型有關，Oct4高表達可作為NSCLC預后差的一個判斷指標。
　　(2)Oct4與NSCLC細胞對吉非替尼的耐藥性有關。特異性沉默Oct

25、4基因表達能夠逆轉NSCLC細胞對吉非替尼的的耐藥性并促進細胞凋亡。
　　(3)p-STAT3/survivin信號通路可能與NSCLC細胞對吉非替尼的的獲得性耐藥有關。Oct4的下調可以逆轉NSCLC細胞對吉非替尼的的獲得性耐藥，其機制可能與p-STAT3/survivin信號通路有關。
　　創(chuàng)新性及意義：
　　本研究發(fā)現Oct4在維持肺腺癌細胞PC-9/GR對吉非替尼的耐藥性方面具有重要作用，選擇性抑制Oct4表達