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文檔簡介
1、本研究利用前期研究中構建的pGEX-BgTX(P22-A31)質粒在大腸桿菌BL21(DE3)中表達并純化后得到了較純的重組α-銀環(huán)蛇毒素同工毒素,得率約為1.225mg/L。用重組蛋白與天然α-銀環(huán)蛇毒素的抗原性一致。重組α-銀環(huán)蛇毒素同工毒素的半致死劑量LD50為1.598mg/kg,約為天然α-銀環(huán)蛇毒素的1/5且有一定的鎮(zhèn)痛藥效,1/4LD50劑量的鎮(zhèn)痛百分率為55-2%,1/8LD50劑量的鎮(zhèn)痛百分率為20.5%,在外周鎮(zhèn)痛作
2、用中呈一定的量效關系。以上結果表明,本研究重組表達的α-銀環(huán)蛇毒素同工毒素(P22-A31)具有與天然α-銀環(huán)蛇毒素相似的生物學活性。 α-銀環(huán)蛇毒素cDNA序列的多態(tài)性及其引起這種多態(tài)性的原因一直存在爭議。本文從同一銀環(huán)蛇個體中克隆并測序了5個α-銀環(huán)蛇毒素基因組序列,又在同一次反轉錄的cDNA中克隆神經(jīng)生長因子的cDNA,并通過計算多個克隆間的突變情況,與同一體系中得到的12種α-銀環(huán)蛇毒素cDNA序列突變率做比較,并統(tǒng)計
3、了前人克隆到的多種α-銀環(huán)蛇毒素cDNA序列突變的情況,得出結論:α-銀環(huán)蛇毒素cDNA序列的多態(tài)性不是由于基因組不同而來的,也不是由RNA編輯造成,很可能是由于反轉錄過程,PCR,基因克隆及DNA測序過程人為引入的。 運用RACE技術從銀環(huán)蛇毒腺cDNA中克隆到2個C型凝集素基因的全長cDNA序列,BML-1和BML-2,其中BML-2是首次從銀環(huán)蛇(Bungarusmulticinctus)中克隆到。并將這2個蛋白135個
4、氨基酸的成熟肽部分和137個氨基酸的成熟肽部分分別連入pET-His載體后在BL21(DE3)plysS中表達,重組蛋白以包涵體的形式存在,復性后的重組C型凝集素具有凝集紅細胞活性。其中由135個氨基酸組成的重組C型凝集素以單體形式存在,由137個氨基酸組成的重組C型凝集素有50%以二聚體的形式存在,另50%以單體形式存在。Westernblotting和親和純化結果表明,天然C型凝集素是以更小分子量的單體形成的二聚體。純化到的4種分子
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