植物維生素E生物合成途徑及調控.pdf

1、作為一種重要的脂溶性抗氧化物質,維生素E(生育酚)在人類和動物的日常膳食中起著不可或缺的作用。維生素E只能在光合自養(yǎng)植物中合成,人類的日常所需攝取白植物源性的食物或藥物補充。近來,借助于基因組學和分子生物學技術,維生素E生物合成途徑的關鍵酶基因已在模式生物擬南芥(Arabidopsis thaliana)和藍藻(Synechocystis sp.PCC 6803)中得以確認并克隆,由此廓清了植物維生物E生物合成途徑的結構。
　　本

2、文以高等植物擬南芥維生素E生物合成途徑關鍵酶編碼基因為基礎,通過轉基因方法對該途徑進行遺傳操作,圍繞維生素E生物合成途徑進行了兩個方向、四個具體內容的研究。
　　一個方向是以模式生物擬南芥為平臺,著力于評價生物合成途徑各位點關鍵酶基因對維生素E合成產生的影響,為提升作物維生素E總量或改變作物維生素E組成提供有效的策略,并在蔬菜作物生菜中進行初步的驗證,成功獲得了大幅度提升維生素E含量和組成的高營養(yǎng)價值的作物品系;另一方向由關鍵酶和

3、代謝途徑作為切入點,研究維生素E在植物生理中的作用,觀察分析了維生素E與維生素C之間的關系,并且探討了維生素E對植物逆境防御的影響。
　　四個具體研究內容概述如下:
　　1)擬南芥遺傳背景下維生素E生物合成途徑關鍵酶作用評價
　　以模式生物擬南芥為平臺,在同一遺傳背景下單獨轉化維生素E生物合成途徑五個關鍵酶基因(hppd、hpt、mpbq mt、tc和y-tmt),通過分析過量表達株系維生素E的含量和組成,對各個關鍵酶

4、在維生素E生物合成途徑中的作用加以評價。實驗發(fā)現(xiàn),轉化維生素E生物合成途徑的關鍵酶基因可以上調細胞內該基因的表達水平,同時促進維生素E含量的提高和/或組成的改變。依據(jù)主要作用的不同,五個關鍵酶大致可以分為兩類——以提高維生素E含量為主要作用(包括HPPD和HPT)和以改變維生素E組成為主要作用(包括MPBQ MT、TC和r-TMT)。在單基因轉化的基礎上,實驗選擇并設計了雙基因轉化策略,分別是組合y-tmt+hpt和y-tmt+mpbq

5、 mt,進一步驗證了單基因轉化評價的結論,并發(fā)現(xiàn)了雙基因轉化對同時提高維生素E的含量和改變維生素E組成有著十分顯著的作用?；诖搜芯?以擬南芥為平臺,建立了一整套可供評價比較的體系,為日后農業(yè)、經(jīng)濟作物的轉基因工作提供有效的策略。
　　2)通過基因工程方法調控生菜維生素E生物合成途徑
　　基于在擬南芥中的研究,選擇擬南芥維生素E生物合成途徑關鍵酶HPT和Y-TMT的基因,分別構建單基因轉化和雙基因共轉化載體,組成性表達于生菜

6、(Lactuca sativa L.var.1ogifolia)中,并獲得含有目的基因的轉基因株系。結果表明,單獨轉化hpt基因的株系可以提高維生素E生物合成途徑的產物量,單獨轉化y-tmt的株系可以改變維生素E的組成,使其中啊a-生育酚的比例大幅提高,雙基因共轉化株系較之非轉基因對照(NC)和單基因轉化株系,大幅度的提高了葉片維生素E的含量,最高達到了64.55μg/g FW,是NC株系葉片維生素E含量的9倍多,是hpt單基因轉化最高

7、表達株系的3倍多。由此得出結論,雙基因共轉化株系可以兼具提高維生素E總量以及改變組成的功能。另外值得注意的是提高下游關鍵酶y-TMT的表達可以正向拉動生物合成,促進反應向下游進行,若同時提升上游關鍵酶的表達,可以明顯提高最終產物量。本實驗為改良蔬菜作物營養(yǎng)品質提供了一個有效的方法。
　　3)基因工程調控維生素E生物合成途徑對植物內源維生素C含量的影響
　　以網(wǎng)絡的角度,維生素E含量的提升可能會對轉基因株系中抗壞血酸(維生素C

8、)產生影響。本實驗對過量單一表達維生素E生物合成途徑關鍵酶的轉基因株系葉片加以對比分析,發(fā)現(xiàn)內源維生素C的總量與維生素E的含量以及a-/y-生育酚比例有負相關性。進一步的分析揭示在轉基因株系中,參與Halliwell-Asada循環(huán)的關鍵酶基因(如apx、dhar和mdar)出現(xiàn)了表達上調,但維生素C生物合成途徑相關基因并沒有出現(xiàn)顯著變化。這些發(fā)現(xiàn)初步揭示了脂溶性抗氧化物質維生素E與水溶性抗氧化物質維生素C之間通過Halliwell-A

9、sada循環(huán)相互聯(lián)系相互影響的關系,這對植物體內氧化還原內穩(wěn)態(tài)的維持及植物生理活動有著重要的影響。本研究有助于進一步了解維生素E在植物生理中的作用,亦有助于為代謝工程提供實踐的指導。
　　4)改變擬南芥生育酚環(huán)化酶(TC)表達水平對維生素E生物合成的影響及其在逆境中的生理功能
　　為研究維生素E在植物生理過程中的作用,通過基因工程方法調控關鍵酶TC的表達水平,構建了過量表達tc和RNAi抑制表達tc的轉基因擬南芥株系,觀察測

10、量了這兩種株系及NC株系在正常生理狀態(tài)和逆境生理狀態(tài)(鹽逆境、干旱逆境)下的多種生理指標。結果表明,過量表達tc導致葉片Y-生育酚含量的顯著提高,a-生育酚幾乎不受影響;RNAi抑制tc的表達導致葉片生育酚含量的缺失,在正常生理狀態(tài)下,雖不會致死,但植株出現(xiàn)了明顯的生長延緩和矮弱現(xiàn)象,并導致維生素C含量的代償性提高。施以不同程度逆境刺激后,與NC株系相比較,過量表達tc的株系的抗逆能力稍有增強。但是RNAi抑制tc表達的株系則出現(xiàn)了對逆